響應(yīng)面法優(yōu)化三葉草中類黃酮提取工藝

陳春剛,韓芬霞,王媛媛

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

近年來,世界上掀起了活性物質(zhì)開發(fā)的熱潮,開發(fā)為人類健康造福的天然植物資源已被認為是世界上最具前景、最有現(xiàn)實意義的行業(yè)之一.一些特效天然藥物成分常因資源稀少、含量低而限制了開發(fā)應(yīng)用.類黃酮（flavonoids）是自然界存在的一大類酚類物質(zhì),是一組廣泛存在于植物的葉、花、果中的天然色素,因多呈黃色而被稱為類黃酮,至今科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)4 000多種類黃酮物質(zhì)[1].天然來源的生物黃酮分子量小,能通過血腦屏障,能進入脂肪組織,具有消除疲勞、保護血管、防動脈硬化、疏通微循環(huán)脂肪氧化、活化大腦及其他臟器細胞的功能[2-3].

三葉草（Trifolium repens L.）是豆科（Leguminosae）草本植物,全世界大約有250余種[4],廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū),我國該植物資源亦十分廣泛.三葉草營養(yǎng)成分十分豐富,其中蛋白質(zhì)含量45%～65%,可利用碳水化合物含量5%～20%,粗纖維含量為0.5%～1.5%,脂肪7%～25%,灰分0.5%～1.5%[5],是牛、羊很好的飼料.在許多國家己成為人們的傳統(tǒng)食品和調(diào)味品,在我國民間也用其花、種子、植株及根部制膏、煎劑和泡茶飲用,具有治療咳嗽、鎮(zhèn)痛和祛痰作用[6].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,三葉草屬植物具有抗癌、抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)激素平衡、抗自由基、降血壓等多方面的藥理作用.目前,三葉草的提取物異黃酮是國際上公認的治療更年期綜合癥療效確切的植物藥[7],其銷量在美國多年來一直名列植物藥的前10位[8],因而三葉草具有非常廣闊的開發(fā)前景.

本課題組發(fā)現(xiàn)在河南省新鄉(xiāng)市地區(qū)廣泛分布的三葉草植物富含類黃酮,具有很高的開發(fā)價值.本文擬利用響應(yīng)面法對三葉草中活性物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化,旨在為三葉草中類黃酮類物質(zhì)的工業(yè)化提取提供依據(jù),以充分發(fā)掘其潛在利用價值.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三葉草；乙醇,蘆丁,氫氧化鈉,硼酸,亞硝酸鈉,硝酸鋁（以上試劑均為分析純,由天津科密歐公司提供）；試驗用水均為蒸餾水,由河南科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院提供.

1.2 主要儀器

MD100-2電子天平（廣州紅星儀器有限公司）；DHG-9000A恒溫干燥箱（上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LGJ-18冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；Fw-400A傾斜式高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；7200分光光度計（上海尤尼科儀器有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（杰瑞爾電器有限公司）.

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 將新鮮三葉草清洗干凈后,冷凍干燥,粉碎,原料粒徑最好在0.2～0.5 mm,最大不超過1 mm.原料粒徑過大,給提取造成困難,粒徑過小,給后續(xù)分離操作帶來困難.

1.3.2 總類黃酮的鑒定和含量測定 先采用鎂粉鹽酸反應(yīng)實驗（取乙醇提取液1 mL于試管中加鎂粉,再加入濃鹽酸數(shù)滴,觀察其顏色的變化）對提取物進行鑒定.參照參考文獻[9]繪制蘆丁濃度－吸光度標準曲線,然后根據(jù)參照文獻[10]測定樣品中總類黃酮的含量.

1.3.3 樣品中類黃酮的提取 稱取1 g左右經(jīng)過脫脂處理的樣品,放入150 mL錐形瓶中,加入一定體積、一定體積分數(shù)的乙醇溶液,在確定的溫度下,振蕩提取一定時間.提取完畢后,立刻抽濾,用乙醇溶液洗滌錐形瓶和抽濾瓶,濾液和洗液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶,定容后,充分混合.準確稱取1 mL定容液于25 mL容量瓶中,用體積分數(shù)為30%的乙醇補充至12.5 mL,加入0.7 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻放置5 min后加入0.7 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液,6 min后再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液5 mL混合均勻,用體積分數(shù)為30%的乙醇稀釋至刻度,10 min后于波長500 nm處測定吸光度,同時做空白實驗.然后在蘆丁濃度吸光度的標準曲線上查出相應(yīng)的類黃酮含量.黃酮提取率按以下公式計算：

式中：x為工作曲線上相應(yīng)的蘆丁濃度（/g/L）；m為樣品質(zhì)量/g.

1.3.3.1 樣品中類黃酮提取的單因素試驗 選取水浴溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間、液固比4個可能影響提取效果的因素做單因素試驗,以三葉草類黃酮的提取率為指標,確定相關(guān)因素的取值范圍.

1.3.3.2 樣品中類黃酮提取的響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素試驗所確定的取值范圍,采用Design-Expert Software7.0中RSM設(shè)計方法,進行水浴溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間、液固比的4因素3水平共21個響應(yīng)面分析試驗（包括4個中心點）.

2 結(jié)果與分析

2.1 類黃酮物質(zhì)的定性試驗結(jié)果

按照1.3.2的方法發(fā)現(xiàn)形成了紫紅色的物質(zhì),發(fā)生了類黃酮類物質(zhì)的特有反應(yīng),可以認為提取物中含有類黃酮類物質(zhì).

2.2 類黃酮總量及提取率

2.2.1 蘆丁標準曲線 用MirosoftExcel做最小二乘法的線性回歸得吸光度與蘆丁濃度的工作曲線為：y=14.945x-0.014 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.999.

2.2.2 類黃酮含量

2.2.2.1 單因素試驗設(shè)計 選取提取時間、液固比、溫度和乙醇體積分數(shù)作為主要影響因素,其單因素試驗結(jié)果分別如圖1至圖4所示.

由單因素分析可知各個單因素對類黃酮提取率的影響程度,可以得到每個單因素的響應(yīng)面試驗的范圍（見表1）.

表1 響應(yīng)面試驗中各因素的取值范圍Tab.1 Single factor rang for RSM experimental design

2.2.2.2 響應(yīng)面分析 使用Design-ExpertSoftware7.0中的響應(yīng)面設(shè)計法（RSM）,進行水浴溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間、液固比的4因素3水平共21個試驗（包括4個中心點）的響應(yīng)面分析.試驗結(jié)果如表2所示.

Design-E xpertSoftware7.0對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行分析后推薦使用“Quadratic”（二次方程式）的數(shù)學(xué)模型.黃酮提取率的數(shù)學(xué)模型如下：

提取率 /%=6.472 53-0.028 585×A+0.721 16×B-0.478 59×C+0.116 19×D-3.850 00E-0.03×A×B+1.475 00E-0.03×A×C+7.875 00E-0 04×A×D+5.000 00E-0.04×B×D-7.000 00E-0.04×B×D-4.750 00E-0.04×C×D-1.419 75E-0 03×A2-0.015 079×B2+3.530 25E-0 03×C2-5.674 36E-0 04×D2.

式中，A為提取時間,B為液固比,C為水浴溫度,D為乙醇體積分數(shù).

表3為方差分析表.由表3可知,P=0.022 6,說明應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系顯著,即這種試驗方法可靠.在本試驗設(shè)定的區(qū)域范圍內(nèi),只有水浴溫度對三葉草中總類黃酮的提取率影響顯著（P＜0.05）,而提取時間、乙醇體積分數(shù)、液固比以及它們之間的交互作用均對提取率的影響不顯著（P＞0.05）.

表3 響應(yīng)面分析表Tab.3 Response surface experimental analytical table

RSA方法的圖形如圖5至圖8所示.圖5、圖6、圖7、圖8中圖形是特定響應(yīng)值Y分別與對應(yīng)的因素A、B、C、D構(gòu)成的一個三維空間圖,可以直觀地反映各因素以及它們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響.從試驗所得響應(yīng)值分析圖可看出它們在反應(yīng)過程中的相互關(guān)系,確定合適的工藝條件.

圖5 提取時間與液固比的交互作用對提取率的影響Fig.5 Influence ofextracting time and ratioof liquid to solid correlation to extraction rate

圖6 提取時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用對提取率的影響Fig.6 Influence ofextracting time and volume fraction ofethanol correlation toextraction rate

圖7 液固比與水浴溫度的交互作用對提取率的影響Fig.7 Influence of temperature and ratio of liquid to solid correlation toextraction rate

圖8 液固比與乙醇體積分數(shù)的交互作用對提取率的影響Fig.8 Influence of ratio of liquid to solid and volume fraction ofethanol correlation toextraction rate

2.2.2.3 最適條件推薦 通過響應(yīng)面試驗,可以得到軟件推薦的最佳工藝為：提取時間24.02 min,液固比為20.49,水浴溫度為80℃,乙醇體積分數(shù)為72.59%.在此條件下,類黃酮的提取率為2.49%.

2.2.3 驗證性試驗 根據(jù)響應(yīng)面試驗所推薦的最適條件,提取時間為24.02 min（取24 min）、乙醇體積分數(shù)為72.59%（取72%）、液固比20.49（取20）、提取溫度為80℃（取80℃）,經(jīng)3次平行試驗測得總類黃酮得率為（2.54±0.11）%,與理論值2.49%差異不顯著（P＞0.05）,說明該預(yù)測值是可靠的.

3 結(jié)論

通過單因素試驗考察了提取時間、液固比、水浴溫度、乙醇體積分數(shù)對三葉草黃酮提取率的影響,并得出了進一步試驗的范圍.通過響應(yīng)面試驗,確定了三葉草黃酮的最佳提取工藝為提取時間24.02 min、乙醇體積分數(shù)72.59%、水浴溫度80℃、液固比20.49,提取次數(shù)為1.該工藝的黃酮提取率可達到2.49%.

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