水體碳氮比對芽孢桿菌、乳酸菌與弧菌生長、拮抗作用及菌體碳氮比的影響＊

高 磊，包衛(wèi)洋，2，張?zhí)煳模瑔魏閭?，馬甡＊＊

（1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003；2.揚州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所，江蘇 揚州225127）

近年來，養(yǎng)殖水體惡化與病害頻發(fā)已成為制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要因素。在對蝦傳統(tǒng)精養(yǎng)模式中，大量投餌與單一的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)令養(yǎng)殖環(huán)境十分脆弱，氨氮與亞硝氮等有害物質(zhì)大量積累；大量換水將外界環(huán)境中的致病菌帶入到養(yǎng)殖水體中，增加了疾病爆發(fā)的風(fēng)險；此外，養(yǎng)殖后期水體氮元素的大量積累導(dǎo)致環(huán)境碳氮比（C∶N）大大降低以至于弧菌病的爆發(fā)，這也嚴(yán)重影響著對蝦的養(yǎng)殖生產(chǎn)［1］。向養(yǎng)殖水體中投放益生菌不僅可以改善養(yǎng)殖水體的微生態(tài)結(jié)構(gòu)組成，使有益菌在水體中占有主導(dǎo)地位，還可以改良水質(zhì)，抑制有害菌的生長，但是益生菌添加技術(shù)也面臨著有益菌不能長時間維持，及難以形成優(yōu)勢菌種等諸多問題。因此，如何促進(jìn)益生菌在水體中的大量繁殖，以及加強益生菌對有害菌的拮抗作用已成為1個亟待解決的問題［2－4］。

通過向養(yǎng)殖水體中添加碳源調(diào)節(jié)水體的C∶N不僅可以促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌的大量繁殖，降低氨氮與亞硝氮在水體中的積累［5－6］，還可以通過形成生物絮團為對蝦提供更多的天然餌料，降低養(yǎng)殖成本［7］。目前國內(nèi)外調(diào)節(jié)環(huán)境C∶N的研究工作主要集中在改善水質(zhì)及促進(jìn)生物絮團形成等方面，而關(guān)于其對養(yǎng)殖水體中主要功能菌與有害菌生長的作用卻鮮有報道。本文旨在研究調(diào)節(jié)水體碳氮比（C∶NW）對芽孢桿菌、乳酸菌與弧菌生長及拮抗作用的影響，并為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的C∶N調(diào)節(jié)技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

實驗所用細(xì)菌于2010年7～10月采集自青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，舟山市綠源水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司與湛江市恒興水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司3處的凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘。將5mL水體樣品或5g底質(zhì)樣品（分離芽孢桿菌時需先將樣品置于80℃水浴中10 min）加入到裝有45mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，富集培養(yǎng)后用無菌海水適當(dāng)稀釋，取0.2mL涂布于固體培養(yǎng)基上，采用劃線分離法對菌株進(jìn)行分離，連續(xù)劃線培養(yǎng)至純。芽孢桿菌的初步鑒定采用孔雀綠染色法［8］，乳酸菌的初步鑒定采用脫脂乳培養(yǎng)法［9］，弧菌的初步鑒定采用氧化酶法［10］。

1.2 培養(yǎng)基配制

芽孢桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基［11］；乳酸菌的培養(yǎng)使用 MRS培養(yǎng)基［12］；弧菌的培養(yǎng)使用TCBS固體培養(yǎng)基與堿性蛋白胨液體培養(yǎng)基［13－14］。

C∶N梯度培養(yǎng)基的配置：將以上3種培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、堿性蛋白胨液體培養(yǎng)基）用無菌海水稀釋至養(yǎng)殖環(huán)境營養(yǎng)水平（TOC＝20mg／L）［15］，并通過添加碳源（葡萄糖）或氮源（（NH4）2SO4），將培養(yǎng)基的C：N分別調(diào)節(jié)至2、5、10、15、20。

1.3 菌株16SrDNA序列鑒定

采用大連寶生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板采用細(xì)菌通用引物對，正向引物27f：5′－AGAGTTTGATC（C／A）TGGCTCAG－3′，反向引物1492r：5′－TACGG（C／T）TACCTTGTTACGACTT－3′，進(jìn)行16SrDNA的PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：最初變性95℃5min；變性95℃30s，復(fù)性55℃1min，延伸72℃2min，30個循環(huán)；最后延伸72℃10min。PCR產(chǎn)物采用大連寶生物科技有限公司DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，將純化樣品送至中國科學(xué)院海洋研究所測序，將所得序列與Genbank中的16SrDNA序列進(jìn)行Blast相似性分析比較。以16SrDNA基因序列同源性A＞99%為鑒定標(biāo)準(zhǔn)［16－17］。

1.4 細(xì)菌篩選

經(jīng)過初步分離、16SrDNA鑒定共得到芽孢桿菌37株、乳酸菌42株及弧菌50株。在細(xì)菌分離培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)不同菌株的生長能力差異較大，部分菌株生長速度慢、繁殖能力差，不利于實驗結(jié)果的觀察，因此將所得菌株分別接種在C∶NW較低（C∶NW＝2）與C∶NW較高（C∶NW＝20）的環(huán)境中培養(yǎng)48h（培養(yǎng)基配制見1.2節(jié)），利用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)菌液進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，篩選出在2種條件下生長水平均較好的菌株，最終得到4株芽孢桿菌（S4、G6、Z5、S5），4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）與4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）用于后續(xù)實驗。

1.5 不同C∶NW對3種細(xì)菌生長、拮抗作用及菌體碳氮比（C：NB）影響的測定

1.5.1 不同C∶NW下細(xì)菌的生長 將芽孢桿菌（S4、G6、Z5、S5）、乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）及弧菌（Z5、Z9、G9、G17）的種子培養(yǎng)液用無菌海水稀釋至103cells／mL水平，分別接種到3種C∶N梯度培養(yǎng)基（見1.2節(jié)）中，于28℃下避光培養(yǎng)72h，每6h取樣一次，利用比濁法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)液吸光度的測定。同時取各菌株不同時期的培養(yǎng)液測定吸光度后用甲醛固定，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的測定，繪制比濁法測定細(xì)菌數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將實驗中測得細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光度換算為細(xì)菌密度（cells／mL）。

經(jīng)上述實驗結(jié)果得知，不同芽孢桿菌（或乳酸菌、弧菌）的生長對C∶NW的響應(yīng)方式基本一致，因此選取生長水平較好的芽孢桿菌Z5菌株、乳酸菌Z13菌株及弧菌Z9菌株作為下文實驗的菌株。

1.5.2 芽孢桿菌與弧菌的競爭作用 預(yù)實驗結(jié)果表明本實驗所篩選芽孢桿菌培養(yǎng)上清液對弧菌的生長無明顯抑制作用（數(shù)據(jù)未顯示），因此選用芽孢桿菌與弧菌共同培養(yǎng)時的生長競爭水平來研究2種細(xì)菌間拮抗作用的變化。將芽孢桿菌Z5菌株與弧菌Z9菌株的種子培養(yǎng)液用無菌海水稀釋至103cells／mL水平，同時接種至LB的C∶N梯度培養(yǎng)基（見1.2節(jié)）中，于28℃下避光培養(yǎng)72h，每12h取樣一次，將菌液樣品用無菌海水稀釋至不同梯度后分別涂布于LB與TCBS平板培養(yǎng)基上，利用平板計數(shù)法分別進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，其中弧菌Z9菌株數(shù)量通過TCBS平板計數(shù)得到，芽孢桿菌Z5菌株數(shù)量通過LB與TCBS平板計數(shù)之差得到（已通過預(yù)實驗驗證芽孢桿菌Z5菌株不能在TCBS培養(yǎng)上生長，且弧菌Z9菌株可以在LB培養(yǎng)基上生長）。

1.5.3 乳酸菌對弧菌的抑制作用 由于乳酸菌（主要為厭氧細(xì)菌）與弧菌（主要為好氧細(xì)菌）的培養(yǎng)環(huán)境不同，且乳酸菌主要通過釋放分泌物實現(xiàn)對有害菌的拮抗作用［18］，因此選用乳酸菌培養(yǎng)產(chǎn)物對弧菌的抑制水平來研究2種細(xì)菌間拮抗作用的變化［9，19－20］。將乳酸菌Z13菌株的種子培養(yǎng)液用無菌海水稀釋至103cells／mL水平，接種至 MRS的C∶N梯度液體培養(yǎng)基（見1.2節(jié)）中，于28℃下避光培養(yǎng)72h，將菌液于10 000r／min下離心3min，利用牛津杯法測定離心上清液對弧菌Z9菌株生長的抑制作用［21］。

1.5.4 細(xì)菌C∶NB的測定 將芽孢桿菌Z5菌株、乳酸菌Z13菌株與弧菌Z9菌株的種子培養(yǎng)液用無菌海水稀釋至103cells／mL水平，分別接種到1.2節(jié)所述C∶N梯度培養(yǎng)基中，于28℃下避光培養(yǎng)48h，將所得細(xì)菌培養(yǎng)液于10 000r／min下離心3min，棄上清液，將菌團用無菌海水反復(fù)沖洗3次后于60℃烘干，利用元素分析儀進(jìn)行碳元素與氮元素含量的測定，通過計算得到細(xì)菌的C∶NB。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用Execl 2010與SPSS11.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用oneway ANOVA方法進(jìn)行方差分析，利用Tukey′s檢驗進(jìn)行顯著性檢驗，采用P＜0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 實驗結(jié)果

2.1 C∶NW對細(xì)菌生長的影響

C∶NW對4株芽孢桿菌生長的影響見圖1。

4株芽孢桿菌（S4、G6、Z5、S5）的生長對 C：NW的響應(yīng)結(jié)果基本一致，相同菌株在不同C∶NW下的生長水平差異明顯。培養(yǎng)24h后4株芽孢桿菌在C∶NW＝15的處理組中生長水平最好，細(xì)菌密度最高達(dá)到6.75×107cells／mL，顯著高于其它處理組（P＜0.05），在C∶NW＝2的處理組中生長水平較差，細(xì)菌密度低于1.20×107cells／mL。Z5菌株生長能力較強，在相同環(huán)境中生長水平高于其它菌株。

C∶NW對4株乳酸菌生長的影響見圖2。

圖2 4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）在不同C∶NW下的生長曲線Fig.2 The growth curves of 4lactic acid bacteria（S9，Z10，Z13，Z14）with different C∶N ratios of the water

4株乳酸菌（S9、Z10、Z13、Z14）在C∶NW≥10的環(huán)境中生長水平較高，對C∶NW的響應(yīng)基本一致。培養(yǎng)24h后乳酸菌S9菌株在C∶NW＝20的處理組中生長水平最好，細(xì)菌密度最高達(dá)到1.32×107cells／mL，顯著高于其它處理組（P＜0.05），乳酸菌Z10、Z13及Z14菌株在C∶NW＝10、15的處理組中生長水平最好，細(xì)菌密度最高達(dá)到2.09×107cells／mL，整體上顯著高于其它處理組（P＜0.05）。Z13菌株生長能力相對較強，在相同環(huán)境中的細(xì)菌密度相對較高。

C∶NW對4株弧菌生長的影響見圖3。

圖3 4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）在不同C∶NW下的生長曲線Fig.3 The growth curves of 4 Vibrio （Z5，Z9，G9，G17）with different C∶N ratios of the water

4株弧菌（Z5、Z9、G9、G17）的生長對C∶NW的響應(yīng)結(jié)果基本一致。培養(yǎng)24h后4株弧菌在C∶NW＝5、10的處理組中生長最好，細(xì)菌密度最高達(dá)到5.07×107cells／mL，整體上顯著高于其它處理組（P＜0.05），在C∶NW＝2的處理組中生長水平較差，細(xì)菌密度低于1.16×107cells／mL。Z9菌株的生長能力相對較強，在相同環(huán)境中的細(xì)菌密度相對較高。

2.2 C∶NW對細(xì)菌間拮抗作用的影響

芽孢桿菌Z5菌株與弧菌Z9菌株在不同C∶NW下的生長結(jié)果見表1。

表1 芽孢桿菌Z5菌株與弧菌Z9菌株在不同C∶NW下的密度變化（mean±S.D.）Table 1 The densities of Bacillus Z5and Vibrio Z9with different C∶N ratios of the water（mean±S.D.）

圖4 不同C∶NW下乳酸菌Z13菌株培養(yǎng)上清液抑制弧菌Z9菌株生長所產(chǎn)生的抑菌圈直徑Fig.4 The inhibition zone diameter of the lactic acid bacteria extracellular products on the growth of Vibrio

當(dāng)C∶NW＝2，5時，弧菌生長水平較高，細(xì)菌密度最高分別可以達(dá)到5.79×107與4.40×107cells／mL，顯著高于芽孢桿菌的生長水平（＜1.32×107cells／mL；P＜0.05）。當(dāng)C∶NW＝10、15、20時，在第12與24h，芽孢桿菌的生長水平（最高可達(dá)4.04×107cells／mL）顯著高于弧菌（＜1.56×107cells／mL；P＜0.05）。

乳酸菌Z13菌株對弧菌Z9菌株的抑制作用結(jié)果見圖4。

當(dāng)C∶NW＝10，15時，乳酸菌培養(yǎng)上清液抑制弧菌生長所產(chǎn)生抑菌圈直徑＞3.0cm，分別達(dá)到3.2與3.1cm，顯著高于其它處理組（P＜0.05）。當(dāng)C∶NW＝2，5時，抑菌圈直徑較小，分別為2.0與2.3cm。

2.3 C∶NW對細(xì)菌C∶NB的影響

圖5 芽孢桿菌Z5菌株，乳酸菌Z13菌株與弧菌Z9菌株的C∶NB在不同C∶NW下的變化Fig.5 The C∶N ratio of Bacillus（Z5），lactic acid bacteria（Z13）and Vibrio（Z9）with different C∶N ratios of the water

整體來說，芽孢桿菌、乳酸菌及弧菌的C∶NB隨C∶NW的升高而上升（見圖5）。芽孢桿菌C∶NB的變化范圍為5.28～7.48，乳酸菌C∶NB變化范圍為3.97～5.04，弧菌C∶NB變化范圍為5.05～15.12。當(dāng)C∶NW≥5時，相同C∶NW條件下的弧菌C∶NB顯著高于芽孢桿菌與乳酸菌的C∶NB（P＜0.05）。

3 討論

添加碳源提高養(yǎng)殖水體C∶N是近年來在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用的環(huán)境調(diào)控方法，通過促進(jìn)與優(yōu)化異養(yǎng)細(xì)菌的生長往往能起到改善水質(zhì)的作用［22－24］。然而，細(xì)菌因自身構(gòu)成與代謝類型的不同，其對環(huán)境C∶N的響應(yīng)也有所差異［25］。芽孢桿菌與乳酸菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有重要作用，常作為有益菌用于水質(zhì)的調(diào)節(jié)與養(yǎng)殖微生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)化，而弧菌在養(yǎng)殖后期往往會集中爆發(fā)［1］，常嚴(yán)重影響對蝦的生長甚至導(dǎo)致死亡。在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中，環(huán)境C∶N會隨著餌料投喂的增加而逐漸降低，探明芽孢桿菌、乳酸菌及弧菌對環(huán)境C∶N變動的響應(yīng)對于養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)境調(diào)控技術(shù)的開發(fā)與優(yōu)化具有重要意義。

碳元素與氮元素是細(xì)菌生長所需要的基本元素，二者的水平直接決定了細(xì)菌生長與繁殖的能力。細(xì)菌對碳元素與氮元素的吸收主要用于構(gòu)成菌體的組成及胞外多糖等胞外產(chǎn)物，以及吸收更多的碳元素用于呼吸消耗［6］。整體來講，海水環(huán)境中的細(xì)菌在較高的C∶N（C∶N＞10）下生長水平較好［25］，同樣也有實驗證實通過添加葡萄糖來提高環(huán)境C∶N可以明顯促進(jìn)海水細(xì)菌的總體生長水平［6］。而在改變水體環(huán)境C∶N的過程中，水體中的細(xì)菌組成及其多樣性也發(fā)生了明顯變化［26］，這說明不同細(xì)菌對環(huán)境C∶N的響應(yīng)與需求水平不同。本文的研究結(jié)果表明，芽孢桿菌最適合于在C∶NW＝15的環(huán)境下生長，而不適合于在C∶NW＝2的環(huán)境下生長；乳酸菌適合于生長在C∶NW≥10的環(huán)境中，而弧菌則在C∶NW＝5，10的環(huán)境中生長較好。這說明了3種細(xì)菌生長環(huán)境的最適C∶N不同，芽孢桿菌與乳酸菌在較高水平的C∶NW下生長較好，而弧菌適宜生長的C∶NW顯著低于芽孢桿菌與乳酸菌。

芽孢桿菌作為養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的有益菌可以在養(yǎng)殖水體中形成有益的微生物菌群，通過與有害菌競爭空間及營養(yǎng)物質(zhì)，可以達(dá)到抑制有害菌群增殖的目的［27］。從芽孢桿菌與弧菌拮抗作用實驗的結(jié)果中可以看到，當(dāng)C∶NW＝2，5時，弧菌生長水平明顯高于芽孢桿菌，在環(huán)境中占據(jù)主要地位，而當(dāng)C∶NW≥10時，芽孢桿菌生長水平明顯超過弧菌，取代弧菌成為水體中的優(yōu)勢菌種。當(dāng)C∶NW＝2時弧菌的生長水平較高可能是由于弧菌更適合在C∶NW較低的環(huán)境下生長以及芽孢桿菌與弧菌間的相互作用導(dǎo)致的，這還需要進(jìn)一步實驗的驗證。當(dāng)C∶NW＝2，5時，培養(yǎng)12h后弧菌的數(shù)量水平保持穩(wěn)定，在實驗過程中沒有出現(xiàn)下降趨勢，這應(yīng)該是因為弧菌在適宜環(huán)境中生長能力較強，通過延長實驗時間可觀察到弧菌生長的衰亡期。因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)中特別是在養(yǎng)殖后期，可以通過提高養(yǎng)殖水體的C∶N來促進(jìn)芽孢桿菌的繁殖，并通過形成不利于弧菌生長的環(huán)境以及芽孢桿菌的拮抗作用來抑制弧菌的生長。

乳酸菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中常用的有益菌添加劑，是對蝦消化道中主要的有益菌之一，可以通過分泌乳酸菌素及其它代謝中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物（如乳酸、乙酸等）形成酸性環(huán)境來抑制有害菌的生長［18］。從乳酸菌對弧菌抑制實驗的結(jié)果中我們可以看到，當(dāng)C∶NW＝10，15時，乳酸菌培養(yǎng)上清液對弧菌的抑制作用明顯高于其他處理組（P＜0.05）。這可能是由于較高的C∶NW為乳酸菌生長提供了充足的碳源，使其酸性代謝產(chǎn)物增多，從而強化了對弧菌的抑制作用。因此提高傳統(tǒng)餌料中的碳含量，降低氮在餌料中的比重，不僅可以節(jié)省成本，減少餌料污染［28－29］，還可以在對蝦消化道中形成適合乳酸菌生長的環(huán)境，加強其對弧菌生長的拮抗作用，降低疾病發(fā)生的機率。

Goldman等［30］與 Wang等［31］的研究表明，海洋細(xì)菌在C∶NW從1.5變化到40的過程中，其C∶NB的變化范圍為3.77～6.47。本研究中，隨著環(huán)境C∶NW水平由2上升至20，芽孢桿菌與乳酸菌的C∶NB變化范圍為3.97～7.48，變化幅度與前述研究結(jié)果相近；而當(dāng)C∶NW≥10時，弧菌的C∶NB＞12，最高達(dá)到15.12，遠(yuǎn)高于弧菌在普通培養(yǎng)條件下的C∶NB（5.79），這表明C∶NW的提高影響了弧菌的菌體組成。Goldman等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，將海水細(xì)菌進(jìn)行連續(xù)性培養(yǎng)時，在C∶NW從5變化到30的過程中，細(xì)菌C∶NB從4.5變化到13.0，并推測這可能是由細(xì)菌極低的生長率及受到影響的菌體生理結(jié)構(gòu)造成的。細(xì)菌在環(huán)境不良時其代謝類型可由初級代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭壌x，并分泌產(chǎn)生多糖類物質(zhì)來抵御不良環(huán)境［33－34］，這可能是導(dǎo)致弧菌C∶NB明顯升高的原因之一，也提示了弧菌不適合于生長在較高C∶NW（≥10）的環(huán)境中。因此C∶NW對細(xì)菌C∶NB的影響導(dǎo)致了不同細(xì)菌的生長對C∶NW的響應(yīng)有所不同，這為今后進(jìn)一步研究C∶NW對細(xì)菌生長的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

綜上所述，通過添加碳源提高至C∶NW≥10的水平不僅可以促進(jìn)芽孢桿菌與乳酸菌的生長，還可以形成不利于弧菌生長的環(huán)境，同時能夠加強芽孢桿菌與乳酸菌對弧菌生長的拮抗作用。因此向養(yǎng)殖環(huán)境和餌料中添加碳源，將碳源添加技術(shù)與添加芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌技術(shù)相結(jié)合，可以成為促進(jìn)益生菌繁殖，優(yōu)化養(yǎng)殖水體微生態(tài)系統(tǒng)的有效措施，同時也為防止養(yǎng)殖后期由于養(yǎng)殖水體C∶N過低導(dǎo)致弧菌爆發(fā)提供了可行途徑。

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