214型離子交換樹脂固定化假絲酵母脂肪酶的研究

錢俊青，蔣盛藍(lán)，秦德懷，郭 輝，凌春英

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310032）

大豆油精制副產(chǎn)物脫臭餾出物是提取天然維生素E的良好原料.但維生素E和脂肪酸、甘油三酯、甾醇等以混溶的形式存在于餾出物中，分離困難.國內(nèi)外許多學(xué)者對從脫臭餾出物中提取天然維生素E做了大量的研究和探討，到目前為止，這些工藝主要有：尿素絡(luò)合法、簡單溶劑萃取法、皂化法、酸催化酯化蒸餾法、超臨界萃取法［1］.目前，生產(chǎn)上常用的這些方法中溶劑用量大對環(huán)境有破壞，對天然維生素E的功能也會產(chǎn)生影響.而酶法預(yù)處理主要是利用脂肪酶將游離脂肪酸甲酯化后將其與維生素E脫除［2］，這是更為理想的方法.假絲酵母脂肪酶在提取天然維生素E的預(yù)處理中良好的催化性能已引起了廣泛關(guān)注.但是在預(yù)處理過程中，脂肪酶會水解甘油三酯產(chǎn)生新的脂肪酸，增加維生素E分離難度.如能降低水解能力，保持酯化能力，將大大有利于天然維生素E的純化預(yù)處理.

樹脂交換吸附法固定化酶是一種簡單的酶固定化方法，這種方法成本低，操作簡單，固定化條件溫和，可再生，固定的酶活力高.固定的脂肪酶在有機(jī)介質(zhì)中有著比在水相中更好的穩(wěn)定性，并且樹脂交換吸附法在一定程度上可以改變酶的催化性能［3－8］.對6種樹脂在固定化假絲酵母脂肪酶中應(yīng)用的效果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，214型離子交換樹脂固定化酶后，酶的水解作用基本消失而酯化能力得到了保持.因此，繼續(xù)對214型樹脂固定化酶的單因素條件進(jìn)行試驗(yàn)及響應(yīng)面研究，并以酶結(jié)合率作為考察指標(biāo)，得到了固定化的最佳條件.在此條件下固定的脂肪酶，水解作用消失，而酯化能力得到保持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

大豆油脫臭餾出物，浙江新昌制藥廠；假絲酵母脂肪酶，北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；離子交換樹脂213，214，312，大孔吸附樹脂 D314，D113，D730，浙江爭光實(shí)業(yè)股份有限公司；水浴恒溫振蕩器SHA－CA，金壇市杰瑞爾電器有限公司.

1.2 離子交換吸附法制備固定化酶

1.2.1 離子交換樹脂的預(yù)處理

用去離子水清洗樹脂三次，除去灰塵等雜質(zhì)；然后用4%的HCl溶液在攪拌下酸洗2h，水洗除去雜質(zhì)，再用4%的NaOH溶液堿洗2h；最后用去離子水水洗至中性，并在去離子水中保存?zhèn)溆?

1.2.2 固定化酶的制備

稱取處預(yù)理過的樹脂，加入5.0mL一定濃度的溶于Tirs－HCl緩沖液的酶液.將錐形瓶置于恒定溫度和轉(zhuǎn)速的恒溫水浴振蕩器中，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，取出樹脂，用去離子水水洗3次，除去樹脂表面未被交聯(lián)的假絲酵母脂肪酶，減壓抽濾后，4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3 酶結(jié)合率的測定及計(jì)算

在制備固定化酶實(shí)驗(yàn)中，分別取固定化前酶液、固定化后剩余酶液在595nm下測定其吸光度值，通過計(jì)算，得到對應(yīng)的酶液濃度.根據(jù)如下計(jì)算公式可得到酶結(jié)合率，即

1.3 固定化酶催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化／水解反應(yīng)

1.3.1 酯化反應(yīng)過程

將3.0g的大豆油脫臭餾出物加入25mL的帶塞磨口錐形瓶中，按照比例加入甲醇，充分搖勻.然后加入適量固定化后的假絲酵母脂肪酶（相同酶量的游離酶做對照實(shí)驗(yàn)），搖勻，最后加入15%緩沖液，pH 8.4Tirs－HCl緩沖液，使其充分混合.將錐形瓶置于恒定溫度30.0℃和轉(zhuǎn)速150r／min的恒溫水浴振蕩器中，反應(yīng)18h后，測定酯化率.

1.3.2 水解反應(yīng)過程

將3.0g大豆油脫臭餾出物加入25mL的帶塞磨口錐形瓶中，直接加入適量固定化后的假絲酵母脂肪酶（相同酶量的游離酶做對照實(shí)驗(yàn)），搖勻，然后加入15%緩沖液，pH 8.4Tirs－HCl緩沖液，使其充分混合.將錐形瓶置于恒定溫度30℃和轉(zhuǎn)速150r／min的恒溫水浴振蕩器中，反應(yīng)18h后測定水解率［9］.

1.4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用 Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法［10］對影響固定化酶結(jié)合量的關(guān)鍵因素進(jìn)行研究和優(yōu)化，以獲得最佳條件及操作水平范圍.實(shí)驗(yàn)輔助軟件為Design Expert 7.1.

以酶結(jié)合量為響應(yīng)值，設(shè)為Y，影響顯著的因子分別以X1，X2，X3代表，按方程xi＝（Xi－X0）／ΔX對自變量進(jìn)行編碼.其中：xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實(shí)值；X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值；ΔX為自變量的變化步長.因子編碼及各自變量水平見表1.

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼1）Table 1 Experimental range and levels of independent variables

設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為

其中：Y為預(yù)測響應(yīng)值；β0為常數(shù)項(xiàng)；βi為線性系數(shù)；βij為交互項(xiàng)系數(shù)；βii為二次項(xiàng)系數(shù).對于影響不顯著的其它工藝參數(shù)，皆選定在單因素最適水平.

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂種類的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇的固定化條件為：樹脂1.0g，酶液5.0mL 10.0mg／mL，水浴溫度30℃，轉(zhuǎn)速150r／min，固定化時間3h.6種樹脂酶結(jié)合率的比較如圖1所示，6種樹脂固定化酶的酯化能力如圖2所示.

由圖1可知：312，214，D314樹脂的酶結(jié)合率相比其他幾種樹脂的更高，這3種樹脂酶結(jié)合能力的排序?yàn)椋篋314＞214＞312.

由圖2可知：在酯化反應(yīng)中，312，214，D314型樹脂固定化的脂肪酶表現(xiàn)出較高的酯化能力；在水解反應(yīng)中，312和214樹脂固定化的脂肪酶水解作用基本消失.因此，312型和214型樹脂固定化的脂肪酶的酯化專一性較強(qiáng)，這也說明這兩種樹脂制成的固定化酶酯化性能更好.

綜上所述，選擇既具有較高的酶結(jié)合率又具有較高酯化能力的以聚丙烯酸為骨架的強(qiáng)堿、弱酸性陰離子樹脂214作為載體對脂肪酶固定化做進(jìn)一步研究.

2.2 酶固定化條件各單因素的優(yōu)化

為了進(jìn)一步研究214型離子交換樹脂固定化的各項(xiàng)條件，對樹脂的量、酶的質(zhì)量濃度、pH、吸附時間、振蕩轉(zhuǎn)速、振蕩溫度6個因素進(jìn)行考察.以酶結(jié)合率為考察指標(biāo)，篩選最適宜的固定化條件.

2.2.1 酶液濃度的篩選

稱取樹脂1.0g分別與5.0mL不同濃度的酶液混合，在水浴溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r／min的條件下固定化3h，結(jié)果如圖3所示.

圖3 酶質(zhì)量濃度對結(jié)合率的影響Fig.3 Effect of lipase concentration amount on binding ratio of lipase

從圖3可以看出：酶結(jié)合率隨酶質(zhì)量濃度的增大而減小；結(jié)合量隨著酶質(zhì)量濃度的增大相應(yīng)增多，當(dāng)酶質(zhì)量濃度超過6.0mg／mL后，結(jié)合量隨酶質(zhì)量濃度增大而小幅減少.由于載體結(jié)合位點(diǎn)有限，隨著載體負(fù)酶量的增大，酶分子間因互相擁擠造成一定的空間位阻，從而不利于酶與載體結(jié)合位點(diǎn)的接觸.酶液質(zhì)量濃度為6.0mg／mL是最適的，此時酶的結(jié)合率較高，單位樹脂上的酶量也是最多的.

2.2.2 樹脂的量的篩選

稱取不同量的樹脂分別與6.0mg／mL和5.0 mL酶液混合于30℃水浴中，在轉(zhuǎn)速150r／min的條件下固定化3h，結(jié)果如圖4所示.

圖4 樹脂量對結(jié)合率的影響Fig.4 Effect of resin's amount on binding ratio of lipase

從圖4可以看出：酶結(jié)合率隨樹脂量的增大而增大；而酶結(jié)合量隨樹脂量的增大而減少.綜合酶結(jié)合率、單位樹脂上的酶量，樹脂的量選取0.75g為宜.

2.2.3 酶液pH 的篩選

稱取0.75g樹脂分別與5.0mL 6.0mg／mL不同pH的酶液混合，水浴溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r／min條件下固定化3h，結(jié)果如圖5所示.

圖5 pH對酶結(jié)合率的影響Fig.5 Effect of pH on binding ratio of lipase

從圖5可以看出：在pH為8.4時，酶結(jié)合率達(dá)到最高的30%.這是由于在特定的pH值下，酶分子上的活性基團(tuán)處于最佳的離子狀態(tài)，易于樹脂上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合.因此，固定化酶的最適pH為8.4.

2.2.4 固定化時間的篩選

稱取0.75g樹脂與6.0mg／mL pH8.4的酶液5.0mL混合，在水浴溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r／min條件下固定化不同的時間，結(jié)果如圖6所示.

圖6 固定化時間對酶結(jié)合率的影響Fig.6 Effect of immobilized time on binding ratio of lipase

從圖6可以看出：隨著固定化時間的延長，酶的結(jié)合率增大；當(dāng)固定化時間超過3h后，增幅變緩并趨于平衡.另外，固定化酶的酯化性能試驗(yàn)顯示在4h處有一個轉(zhuǎn)折，先增大后減小.這是由于214樹脂上的羥基數(shù)量有限，一定時間后，結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，另外酶與酶之間過于聚集也造成了一定的空間位阻.綜合考慮，固定化的時間取4h為佳.

2.2.5 振蕩轉(zhuǎn)速的篩選

稱取0.75g樹脂與6.0mg／mL pH8.4的酶液5.0mL混合，在水浴溫度30℃、不同振蕩轉(zhuǎn)速條件下固定化4h，結(jié)果如圖7所示.

從圖7可以看出：最佳振蕩轉(zhuǎn)速為150r／min，此時酶結(jié)合率為28.32%，而振蕩轉(zhuǎn)速超過200 r／min，酶結(jié)合率顯著下降.可能是由于振蕩轉(zhuǎn)速過快，導(dǎo)致酶從樹脂結(jié)合位點(diǎn)脫落.

圖7 振蕩轉(zhuǎn)速對酶結(jié)合率的影響Fig.7 Effect of rotate speed on binding ratio of lipase

2.2.6 水浴溫度的篩選

稱取0.75g樹脂與6.0mg／mL pH8.4的酶液5.0mL混合，于轉(zhuǎn)速150r／min、不同的水浴溫度下固定化4h，結(jié)果如圖8所示.

圖8 固定化溫度對酶結(jié)合率的影響Fig.8 Effect of immobilized temperature on binding ratio of lipase

從圖8可以看出：在30～35℃時，脂肪酶結(jié)合率較高.當(dāng)溫度高于40℃后，酶的結(jié)合率反倒下降.因此，水浴溫度控制在30～35℃時，效果最好.從圖8中可知，酶結(jié)合率最高的水浴溫度為30℃.

2.3 酶固定化條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 酶固定化的條件響應(yīng)面優(yōu)化分析

根據(jù)酶固定化的二次多元回歸方程，分別繪制響應(yīng)面圖及其等高線圖，結(jié)果見圖9—11.

由響應(yīng)面圖可知：緩沖溶液pH值和酶濃度對固定化酶活的交互影響不顯著（圖9），而當(dāng)固定振蕩轉(zhuǎn)速時，高酶結(jié)合量在pH（8.2～8.5）和5.5～7.5mg／mL時得到.酶液質(zhì)量濃度和振蕩轉(zhuǎn)速對固定化酶活的交互影響較顯著（圖10），而當(dāng)pH為8.4時，高酶結(jié)合量在酶液質(zhì)量濃度（5.5～7.5mg／mL）和轉(zhuǎn)速125～200r／min獲得.pH和轉(zhuǎn)速對固定化酶活的影響也較顯著（圖11），而當(dāng)酶濃度為為6.0mg／mL時，高酶結(jié)合量則在pH（8.2～8.45）和轉(zhuǎn)速130～200r／min獲得.

由軟件分析得到最佳固定化條件為酶液質(zhì)量濃度6.09mg／mL，pH 8.4，振蕩轉(zhuǎn)速134.26r／min，固定化酶預(yù)測值為酶結(jié)合量為10.46mg／g樹脂.

2.3.2 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型方程的合適性和有效性，進(jìn)行了最適脂肪酶固定化條件的驗(yàn)證試驗(yàn).重復(fù)五次的固定化酶酶結(jié)合量的平均值為11.03mg／g樹脂，試驗(yàn)值與預(yù)測值吻合情況良好.可見該模型可以用于預(yù)測脂肪酶的固定化規(guī)律，證明了此模型是合適有效的，并具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義.

酶固定化條件優(yōu)化后，固定化酶結(jié)合量為11.03 mg／g樹脂，比優(yōu)化前增加.并且酶的水解作用消失，可以在VE提取的預(yù)處理反應(yīng)中獲得較好的甲酯化效果.

3 結(jié) 論

從6種樹脂中篩選出了聚丙烯酸為骨架的強(qiáng)堿、弱酸性陰離子樹脂214作為固定化假絲酵母脂肪酶的最適載體.在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法對214型離子交換樹脂固定化假絲酵母脂肪酶工藝進(jìn)行優(yōu)化.得到的最佳工藝為：5mL酶液中加入0.75g樹脂，酶液質(zhì)量濃度為6.09mg／mL，緩沖液pH 8.40，振蕩轉(zhuǎn)速為134.26r／min，固定化溫度為30℃，固定化時間4h.根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的最佳固定化條件下制得的固定化酶結(jié)合量為11.03mg／g樹脂，此條件下的固定化酶在甲酯化反應(yīng)中水解基本消失，而酯化能力可以得到保持.這將使從大豆脫臭餾出物中提取天然維生素E的酶法預(yù)處理效果更好.

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