α－倒稔子素亞微乳在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及血漿蛋白結(jié)合率研究

單偉光，陶 蓉，宋必衛(wèi)

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310032）

倒稔子素是從傳統(tǒng)藥物山竹干燥果皮中分離得到的氧雜蒽酮類化合物［1］，常用于腹痛腹瀉、痢疾、瘧疾、傷口感染及潰瘍等治療，其主要成分為α－倒稔子素.近年來的研究表明：α－倒稔子素在抗炎［2］、抗細(xì)菌真菌［3］、抗腫瘤［4］、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化［5］、抗糖尿病［6］、抗纖維化［7］、抗組胺及鎮(zhèn)痛［8］等方面均有顯著作用，有望成為治療腫瘤、心血管系統(tǒng)等疾病的潛在候選藥物，因此該藥具有十分廣闊的開發(fā)前景.然而目前對(duì)α－倒稔子素的研究主要集中在體外藥理活性上，而對(duì)其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及血漿蛋白結(jié)合率相關(guān)研究還未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法研究α－倒稔子素亞微乳在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律及血漿蛋白結(jié)合率，為α－倒稔子素的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重220～250g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（浙）2008－0033.

1.2 藥品與試劑

α－倒稔子素（浙江工業(yè)大學(xué)天然藥物課題組提供，純度為98.5%）；α－倒稔子素亞微乳（參照瑞典Kabivitrum公司生產(chǎn)的Intralipid亞微乳注射液的處方（國際通行的亞微乳配方）來制備α－倒稔子素亞微乳注射液，平均粒徑165nm）；α－倒稔子素、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品（Aladdin，純度＞98%）；甲醇（Merck公司）；其他試劑均為分析純.

1.3 儀 器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；干熱式氮吹儀（青島?？苾x器有限公司，DCY－24G）；低溫離心機(jī)（Heraeus，LDZ5－2）；渦旋混勻器（上海醫(yī)大儀器廠，XW－80A）.

2 方 法

2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：RP zobax SB－C18（150mm×4.60mm，5μm）；預(yù)柱C18（25×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇（溶劑A）和水（溶劑B）梯度洗脫：0～4min 70%A，4～8min 73%A，8～16min 85%A，16～18min 95%A，18～24min 95%A；檢測波長312nm；流速1mL／min；進(jìn)樣量10μL.

2.2 樣品處理

取0.1mL血漿加0.4mL含內(nèi)標(biāo)厚樸酚（2.4μg）的乙酸乙酯溶液，旋渦振蕩混合1.0min，超聲1.0min，5 000r／min離心，上清液氮?dú)獯蹈?，加甲?.1mL復(fù)溶，微孔濾膜過濾，取10μL進(jìn)樣分析.透析外液樣品的處理方法同血漿樣品.

2.3 色譜條件專屬性考察

采用2.1的HPLC－UV色譜條件，考察空白血漿樣品、空白血漿＋對(duì)照品＋內(nèi)標(biāo)、血漿實(shí)驗(yàn)樣品的色譜行為.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在空白血漿和平衡透析液中添加α－倒稔子素對(duì)照品，使質(zhì)量濃度相當(dāng)于0.10，0.30，1.00，3.00，10.00，30.00，100.00μg／mL，按照樣品處理項(xiàng)進(jìn)行處理并進(jìn)樣測定，記錄色譜信息.所得數(shù)據(jù)用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，以α－倒稔子素與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值比為縱軸，α－倒稔子素濃度為橫軸，考察α－倒稔子素的線性范圍.

2.5 最低定量限（LLOQ）

取空白血漿加α－倒稔子素對(duì)照品，精密配制成系列α－倒稔子素質(zhì)量濃度的樣品，按樣品處理項(xiàng)下處理方法處理并測定，記錄色譜信息，以測定信號(hào)噪音比為10∶1時(shí)為最低定量限.

2.6 回收率

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別精密加入α－倒稔子素對(duì)照品配制成含α－倒稔子素質(zhì)量濃度為0.31，1.25，5.00μg／mL的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，按樣品處理項(xiàng)下處理樣品并進(jìn)行HPLC測定，記錄色譜信息；另外，用流動(dòng)相配制α－倒稔子素0.31，1.25，5.00μg／mL的高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度各5份，HPLC測定，記錄色譜信息，評(píng)價(jià)α－倒稔子素在培養(yǎng)液中的方法回收率與提取回收率.

2.7 精密度

用大鼠空白血漿配制含α－倒稔子素質(zhì)量濃度為0.31，1.25，5.00μg／mL的血漿樣品，分別一天內(nèi)連續(xù)測定5次和連續(xù)測定5d.記錄色譜信息，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度.

2.8 血漿樣品的采集與處理

取Wister大鼠6只，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)食12h，自由飲水，以8mg／kg劑量尾靜脈注射α－倒稔子素亞微乳.于給藥后5，10，15，20，30，45，60，90，120，180，240及360min經(jīng)斷尾取血約0.3mL至肝素抗凝管中，3 500r／min離心10min，取血漿0.1mL同2.2處理，取10μL進(jìn)樣分析記錄色譜信息，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各時(shí)點(diǎn)的血藥濃度，DAS 2.0分析計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù).

2.9 血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)

將α－倒稔子素亞微乳（2mg／mL）用平衡透析液分別稀釋成1，3，10μg／mL，各取50mL置于小燒杯中.精密量取肝素抗凝的空白血漿500μL至透析袋（截留分子量8 000，直徑11.5mm），夾緊并懸于各燒杯中，調(diào)整透析袋位置于4℃冰箱中平衡透析72h.透析后用30%磺基水楊酸檢測袋外有無蛋白質(zhì)泄露，泄露則棄之重做.透析后，精密量取血漿100μL同2.2處理，取10μL進(jìn)樣分析記錄色譜信息，用標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出各血藥濃度，血漿蛋白結(jié)合率公式為

式中：Dt為袋外透析液藥物的質(zhì)量濃度，μg／mL；Df為袋內(nèi)血漿藥物的質(zhì)量濃度，μg／mL.

3 結(jié) 果

3.1 色譜條件專屬性

分別將空白血漿，空白血漿加對(duì)照品及血漿樣品的色譜圖（圖1）進(jìn)行對(duì)比來考察方法的專屬性，結(jié)果表明，α－倒稔子素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別19.4和15.1min，其中內(nèi)源性物質(zhì)的保留時(shí)間為20.8min，無相互干擾，方法專屬性良好.

3.2 線性范圍試驗(yàn)

α－倒稔子素在血漿中的回歸方程為Y＝0.418 9X＋0.099 5（R2＝0.999 2）；α－倒稔子素在透析外液中的回歸方程為Y＝0.405 4X＋0.098 8（R2＝0.999 3）.線性范圍為0.10～100.00μg／mL，定量下限為40ng／mL.

3.3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

表1為HPLC法測定血漿內(nèi)和透析外液中α－倒稔子素含量的回收率和精密度，結(jié)果表明：日內(nèi)、日間精密度RSD＜8%，相對(duì)回收率在98%～105%之間，絕對(duì)回收率大于71%，滿足α－倒稔子素含量測定的要求.

圖1 α－倒稔子素在血漿中的色譜圖，厚樸酚作為內(nèi)標(biāo)Fig.1 HPLC chromatograms ofα－mangostin with magnolol as the internal standard

表1 HPLC法測定大鼠血漿中α－倒稔子素質(zhì)量濃度的精密度及回收率結(jié)果Table 1 Precision and recovery of HPLC testing concentration ofα－mangostin in biological samples

3.4 大鼠體內(nèi)α－倒稔子素血藥質(zhì)量濃度的測定

血漿樣品測定時(shí)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線以及質(zhì)控樣品，計(jì)算出未知樣品的質(zhì)量濃度.質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度不得超過理論值的15%，否則該數(shù)據(jù)不被接受.大鼠按8mg／kg尾靜脈注射α－倒稔子素亞微乳后，其平均血藥質(zhì)量濃度—時(shí)間曲線如圖2所示.采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)分析軟件進(jìn)行房室擬合，根據(jù)程序自動(dòng)進(jìn)行推算、模擬和權(quán)重選擇（以赤池信息AIC判斷），α－倒稔子素亞微乳靜注后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表2所示.結(jié)果表明：擬合的藥—時(shí)曲線符合靜脈推注給藥二室模型（AIC值為1.31）.

圖2 大鼠靜脈注射α－倒稔子素亞微乳后的平均藥時(shí)曲線Fig.2 Mean concentration－time profile forα－mangostin in rat plasma

表2 α－倒稔子素亞微乳注射液在大鼠中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)1）Table 2 PK parameters ofα－mangostin injection in rat

3.5 α－倒稔子素的血漿蛋白結(jié)合率

考察低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（1，3，10μg／mL）α－倒稔子素的血漿蛋白結(jié)合率，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣品分析，結(jié)果顯示：上述3個(gè)質(zhì)量濃度的結(jié)合率分別為（62.3±1.3）%，（60±3.3）%和（57.4±1.6）%，呈中等強(qiáng)度的血漿蛋白結(jié)合率，代表色譜圖見圖3.

圖3 α－倒稔子素在血漿及透析液中的含量比較Fig.3 The representative chromatogram ofα－mangostin in the plasma and buffer

4 結(jié) 論

建立了α－倒稔子素在血漿中HPLC分析方法，研究其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和血漿蛋白結(jié)合率.在該色譜條件下α－倒稔子素的峰形良好，最低檢測限為40ng／mL，提取回收率達(dá)71%～78%，方法回收率大于98%，日內(nèi)、日間精密度RSD＜8%，在0.1～100.0μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能夠滿足α－倒稔子素的含量測定要求.根據(jù)DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)分析軟件自動(dòng)推算和權(quán)重選擇，擬合的藥—時(shí)曲線符合靜脈推注二室模型，主要分為快速分布相和慢速消除相兩個(gè)階段，其中t1／2α＜5.0min，t1／2β＞3.9h，即分布半衰期較短及消除半衰期較長，結(jié)果提示α－倒稔子素在周邊室具有較強(qiáng)的組織親和力.α－倒稔子素血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)結(jié)果顯示其平均結(jié)合率為60%，呈中等強(qiáng)度結(jié)合，即靜脈注射給藥初期血漿中游離藥物比例較高.該性質(zhì)結(jié)合其高脂溶性的特點(diǎn)，可促進(jìn)α－倒稔子素透過毛細(xì)血管向周邊室擴(kuò)散.

［1］OBOLSKIY D，PISCHEL I，SIRIWATANAMETANON N，et al.GarciniamangostanaL.：aphytochemical and pharmacological review［J］.Phytother Res，2009，23：1047－1065.

［2］NAKATANI K，YAMAKUNI T，KONDO N，et al.Gammamangostin inhibits inhibitor－kappaB kinase activity and decreases lipopolysaccharide－induced cyclooxygenase－2gene expression in C6rat glioma cells［J］.Mol Pharmacol，2004，66（3）：667－674.

［3］SAKAGAMI Y，IINUMA M，PIYASENA K G，et al.Antibacterial activity of alpha－mangostin against vancomycin resistant enterococci（VRE）and synergism with antibiotics［J］.Phytomedicine，2005，12（3）：203－208.

［4］MATSUMOTO K，AKAO Y，OHGUCHI K，Xanthones induce cell－cycle arrest and apoptosis in human colon cancer DLD－1cells［J］.Bioorg Med Chem，2005，13（21）：6064－6069.

［5］BUELNA－CHONTAL M，CORREA F，HERNáNDEZRESéNDIZ S，et al.Protective effect ofα－mangostin on cardiac reperfusion damage by attenuation of oxidative stress［J］.J Med Food，2011，14：1370－1374.

［6］BUMRUNGPERT A，KALPRAVIDH R W，CHUANG C C，et al.Xanthones from mangosteen inhibit inflammation in human macrophages and in human adipocytes exposed to macrophage－conditioned media［J］.J Nutr，2010，140（4）：842－847.

［7］CHIN Y W，SHIN E，HWANG B Y，et al.Antifibrotic constituents fromGarciniamangostana［J］.Nat Prod Commun，2011，6（9）：1267－1268.

［8］LU Z X，HASMEDA M，MAHABUSARAKAM W，et al.Inhibition of eukaryote protein kinases and of a cyclic nucleotide－binding phosphatase by prenylated xanthones［J］.Chem Biol Interact，1998，114（1／2）：121－140.