重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2成熟肽在大腸桿菌中融合可溶表達(dá)

林陳水，陳 洪

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州310032）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）最早是由Urist［1］在1965年對(duì)脫鈣骨基質(zhì)的成骨研究中發(fā)現(xiàn)的，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）超家族成員［2］.其中BMP－2被認(rèn)為是眾多骨形發(fā)生蛋白中活性最強(qiáng)且唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子［3］，因此研究非常廣泛.hBMP－2的cDNA全長(zhǎng)1 587bp，開(kāi)放閱讀框1 188bp，編碼有396個(gè)氨基酸的蛋白，包括N端的信號(hào)肽、中間的前肽以及C端的成熟肽三部分.人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2成熟肽（hBMP－2m）為114個(gè)氨基酸，含七個(gè)半胱氨酸殘基，其中六個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，另一個(gè)用于形成分子間二硫鍵，二聚體形式才具有生物學(xué)活性.目前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)在許多真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如：COS［4］，CHO［5］以及人肺癌細(xì)胞［6］等真核細(xì)胞中表達(dá)出了具有良好活性的完整的hBMP－2.然而，真核表達(dá)具有成本高，產(chǎn)量低，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，以大腸桿菌為主的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠克服這些缺點(diǎn).大腸桿菌表達(dá)的hBMP－2卻大多以包涵體的形式存在［7－8］，需要通過(guò)復(fù)雜的裂解復(fù)性過(guò)程才能的得到具有活性的hBMP－2.孫傳秀等［9］通過(guò)融合伴侶的增溶作用實(shí)現(xiàn)了hBMP－2在大腸桿菌中的可溶性表達(dá).研究表明：在大腸桿菌中表達(dá)的不同長(zhǎng)度的羧基肽均有不同程度的誘骨活性［10－11］，而越接近成熟肽的羧基肽誘骨活性就越好［12］.趙明等［13］率先在大腸桿菌中表達(dá)hBMP－2m，經(jīng)復(fù)性獲得與完整肽相當(dāng)?shù)牧己没钚?Bessa等［14］在大腸桿菌中表達(dá)的hBMP－2m經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的堿性裂解即可得到可溶hBMP－2m單體和二聚體.Ihm等［15］則實(shí)現(xiàn)了人工合成的hBMP－2m的可溶性表達(dá).

N－利用基質(zhì)（NusA）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)由Davis［16］發(fā)明，能夠顯著提高在大腸桿菌中難溶的重組表達(dá)蛋白的可溶性［17－19］，其優(yōu)點(diǎn)是融合表達(dá)的蛋白去除或不去除NusA融合伴侶，目的蛋白都具有活性，因此，NusA融合標(biāo)簽成為目前在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)使用最為廣泛的融合標(biāo)簽之一［20］.筆者擬構(gòu)建以NusA為融合伴侶的胞內(nèi)融合表達(dá)載體，使hBMP－2m基因重組于NusA的下游，在大腸桿菌表達(dá)中實(shí)現(xiàn)hBMP－2m的可溶性表達(dá).在NusA與hBMP－2m 之 間 含 “Linker peptide－6His tag－EK－site”序列，有利于融合蛋白的分離純化和實(shí)現(xiàn)融合伴侶與目的蛋白的切割.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH5α菌株，E.coliBL21（DE3）菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pDsbA－h(huán)BMP－2m質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，該質(zhì)粒含編碼DsbA（SP－）－GSGSG－6HisTag－DDDDK－h(huán)BMP－2m的重組DNA序列.

1.1.2 試 劑

T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ及AflⅡ購(gòu)自 Fermentas，PfuDNA 聚合酶，TaqplusDNA聚合酶均購(gòu)自上海Sangon；B型小量質(zhì)粒快速提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物科技有限公司，3SDNA Gel Purification Kit購(gòu)自北京莊盟生物科技有限公司；100bp Loading DNA Marker為杭州愛(ài)思進(jìn)生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Protein Molecular Weight Marker購(gòu)自 MBI；引物合成和測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成.

1.2 方 法

1.2.1 工程菌的構(gòu)建

以E.coliDH5α基因組 DNA 為模板，以引物NusA1：5′－AATCATATGAACAAAGAAATTTT GGCTGT－3′（劃線部分為NdeI酶切 位點(diǎn)）；NusA2：5′－AAACTTAAGCTCGCTTCGTCACCGAA CCAG－3′（劃線部分為AflII酶切位點(diǎn)）分別為正反引物，PfuDNA聚合酶PCR擴(kuò)增得到NusA基因片段，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min，進(jìn)入PCR循環(huán)：94℃變性0.5min，68℃退火0.5min，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和AflⅡ進(jìn)行雙酶切后，重組于pDsbA－h(huán)BMP－2m，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α.以 T7測(cè)序引物、NusA2分別作為正反向引物，菌落PCR鑒定篩選出陽(yáng)性克隆子［21］；陽(yáng)性克隆送金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建胞內(nèi)融合表達(dá)型載體pNusA－h(huán)BMP－2m.重 組 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 化E.coliBL21（DE3），得到基因工程菌E.coliBL21（DE3）／pNusA－h(huán)BMP－2m.

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析

挑取基因工程菌E.coliBL21（DE3）／pNusA－h(huán)BMP－2m單菌落，接入含有50μg／mL Kan的 LB培養(yǎng)基中，37℃，200r／min振蕩過(guò)夜，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接于含有50μg／mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃，200r／min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí)，添加終質(zhì)量濃度為0.1mmol／L的異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），30 ℃誘導(dǎo) 3h.5 000r／min離心15min收集菌體，用pH 8.0，50mmol／L Tris－HCl緩沖液重懸后進(jìn)行超聲破碎（超聲3s，間隔4s，重復(fù)300次）.細(xì)胞破碎液在12 000r／min下離心10min，分別收集上清和沉淀，用濃度為15%的SDS－PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R－250進(jìn)行染色后，觀察上清和沉淀中融合蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.3 融合蛋白的初步純化

將步驟1.2.2中的收集上清溶液與1MNaCl溶液等體積混合，以1mL／min的速度上樣于經(jīng)過(guò)Buffer A（500mmol／L NaCl，50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0）平衡過(guò)的 Ni2＋瓊脂糖凝膠柱中，再次平衡后，用50mL的預(yù)洗液（50mmol／L咪唑，500 mmol／L NaCl，50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0）預(yù)洗非特異性結(jié)合蛋白；接著再用50mL的洗脫液（150 mmol／L 咪唑，500mmol／L NaCl，50mmol／L Tris－HCl，pH 8.0）進(jìn)行洗脫，即得到目標(biāo)融合蛋白.用濃度為15%的SDS－PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R－250進(jìn)行染色后，觀察各部分的目的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，初步確定純化效率.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以E.coliDH5α為模板，NusA1，NusA2分別為正反向引物，用PfuDNA聚合酶經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到表觀分子量為1 500bp左右的片段，與理論NusA基因片段大小相符（圖1）.

圖1 NusA基因克隆Fig.1 Amplifation of NusA gene

NusA基因經(jīng)雙酶切后，重組于pDsbA－h(huán)BMP－2m.轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，用 T7測(cè)序引物和 NusA2分別作為正反向引物經(jīng)菌落PCR，擴(kuò)增得到與NusA基因大小略大的PCR片段，初步說(shuō)明NusA片段成功置換DsbA基因.經(jīng)測(cè)序證實(shí)，確定pNusA－h(huán)BMP－2m構(gòu)建成功.質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖2.

2.2 重組蛋白的表達(dá)量及可溶性表達(dá)情況

工程菌在200mL含有終質(zhì)量濃度為50μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩至OD600為0.5時(shí)，經(jīng)終質(zhì)量濃度為0.1mmol／L的IPTG誘導(dǎo)3h后，離心收集菌體.再超聲破碎細(xì)胞后離心收集上清和沉淀，上清和沉淀均經(jīng)SDS－PAGE凝膠電泳分析.從圖3中可以看出：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可得到大量的的融合蛋白；凝膠定量軟件Quantity One分析可知：融合蛋白占細(xì)胞內(nèi)總蛋白的45%左右，融合蛋白的表觀分子量約為75kDa，與理論分子量相符.同時(shí)，融合蛋白主要以可溶形式表達(dá)于細(xì)胞中，可溶部分占總?cè)诤系鞍椎?0%以上，說(shuō)明NusA對(duì)hBMP－2m的增溶效果良好.

圖2 pNusA－h(huán)BMP－2m質(zhì)粒圖譜Fig.2 Map of plasmid pNusA－h(huán)BMP－2m

圖3 重組蛋白的可溶性表達(dá)鑒定Fig.3 Identification of soluble expression of recombinant protein

2.3 融合蛋白的純化

由于融合蛋白中含有6×His親和純化標(biāo)簽，可經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的Ni2＋柱一步純化即可得到較純的目的融合蛋白.經(jīng)上樣—預(yù)洗—洗脫后，各個(gè)部分經(jīng)SDS－PAGE分析（圖4），經(jīng) Quantity One分析，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的一步純化，目的蛋白純度達(dá)到90%左右.

3 結(jié) 論

圖4 融合蛋白的分離純化Fig.4 Purification of the recombinant protein by Nickel column

骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，廣泛分布于動(dòng)物骨組織，能在非骨組織如肌肉中誘導(dǎo)新骨形成，是一種高效的骨誘導(dǎo)蛋白.在骨及牙齒的生長(zhǎng)和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用.進(jìn)一步研究表明：它在形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞分化過(guò)程中也極為重要.由于潛在的應(yīng)用價(jià)值，有關(guān)BMP－2的研究成為熱點(diǎn).筆者在實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pDsbA－h(huán)BMP－2m基礎(chǔ)上，以NusA代替DsbA作為融合伴侶，構(gòu)建利用增溶標(biāo)簽NusA融合表達(dá)hBMP－2m的基因工程菌，并考察NusA對(duì)hBMP－2m的增溶作用，結(jié)果表明大部分目標(biāo)蛋白以可溶形式表達(dá)于大腸桿菌中.筆者實(shí)現(xiàn)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白hBMP－2m在胞內(nèi)的可溶性表達(dá)，防止蛋白質(zhì)在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)形成包涵體，避免包涵體裂解的步驟.融合蛋白可用簡(jiǎn)單的金屬螯合層析分離純化，為hBMP－2m的體外折疊，獲得正確空間結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了條件.構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，在hBMP－2mN端設(shè)計(jì)了腸激酶酶切位點(diǎn)DDDDK，使表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過(guò)腸激酶切割后得到的蛋白序列與天然的hBMP－2m氨基酸序列完全一致，更有利于開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床藥物.融合蛋白經(jīng)體外復(fù)性、酶切獲得hBMP－2m，再二聚體化而獲得有生物學(xué)活性的hBMP－2m，為該技術(shù)路線的探索創(chuàng)造了條件.

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