成團(tuán)泛菌依賴型磷酸甘油酸變位酶基因的克隆、序列分析及產(chǎn)氫中的差異表達(dá)

馬穎超, 朱大玲, 王廣策

(1. 天津科技大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300457; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071)

磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase,PGM; EC5.4.2.1)是糖酵解過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶, 主要催化 3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate, 3-PGA)與2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2-PGA)之間的可逆反應(yīng)[1-2]。PGM有兩種類型: 一種為依賴型磷酸甘油酸變位酶(cofactor-dependent phosphoglycerate mutase, dPGM), 行使功能時(shí)需要輔因子(cofactor)2,3-二磷酸甘油酸(2, 3-bisphosphoglycerate, 2,3-BPGA), 存在于所有脊椎動(dòng)物、大部分無脊椎動(dòng)物、部分真菌以及某些細(xì)菌中, 特別是革蘭氏陰性菌中; 另外一種為非依賴型磷酸甘油酸變位酶(cofactor-independent phosphoglycerate mutase, iPGM),催化反應(yīng)時(shí)不需要 2, 3-BPGA 作為輔因子, 存在于所有植物、一些無脊椎動(dòng)物、部分真菌和細(xì)菌中, 特別是革蘭氏陽性菌中[3-8]。碳水化合物, 尤其是葡萄糖是異養(yǎng)微生物的主要能源, 用于維持正常的生命活動(dòng)及生命特征, 而糖酵解又是利用葡萄糖的必經(jīng)之路, 也是微生物利用葡萄糖的第一步, 所以糖酵解在異養(yǎng)微生物中具有重要作用[9]。氫氣是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物, 它的產(chǎn)生離不開糖酵解, 而糖酵解中的關(guān)鍵酶之一PGM也必定與產(chǎn)氫有著密切關(guān)系。然而, 目前僅對這兩種PGM的基因及蛋白結(jié)構(gòu)方面有很多報(bào)道, 有關(guān)PGM在氫氣產(chǎn)生方面的研究卻幾乎沒有, 因此, 研究 PGM 與產(chǎn)氫的關(guān)系, 進(jìn)而通過調(diào)控糖酵解作用來提高氫氣產(chǎn)量是一個(gè)新的研究方向, 具有重要意義。

成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)BH-18是從紅樹林污泥中分離純化獲得的一株革蘭氏陰性、兼性厭氧、高效產(chǎn)氫菌株[10]。該菌具有生長條件簡單、耐氧、耐鹽等優(yōu)點(diǎn), 是優(yōu)良的高效產(chǎn)氫候選工程菌株。故本實(shí)驗(yàn)以成團(tuán)泛菌BH-18為對象, 克隆了編碼dPGM的基因序列, 并對其序列進(jìn)行分析, 同時(shí)采用RT-PCR的方法監(jiān)測了成團(tuán)泛菌BH-18在產(chǎn)氫過程中dPGM基因轉(zhuǎn)錄水平上的變化, 為進(jìn)一步研究成團(tuán)泛菌產(chǎn)氫機(jī)理, 進(jìn)而改造獲得高效產(chǎn)氫菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

成團(tuán)泛菌BH-18是從廣西省北海(109°E, 21°N)紅樹林污泥中分離得到的高效產(chǎn)氫菌株。所用的培養(yǎng)基為LMH培養(yǎng)基(pH7.2～7.5), 培養(yǎng)條件為37℃振蕩培養(yǎng)[10]。用于提取細(xì)菌總DNA的成團(tuán)泛菌接種于含有100 mL LMH培養(yǎng)基的錐形瓶中; 用于提取產(chǎn)氫過程中細(xì)菌總RNA的成團(tuán)泛菌接種于含有200 mL LMH培養(yǎng)基的血清瓶中, 充入惰性氣體后進(jìn)行間歇產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)。

1.2 編碼dPGM基因的克隆

1.2.1 成團(tuán)泛菌BH-18總DNA的提取

取對數(shù)期的成團(tuán)泛菌BH-18, 采用常規(guī)酚-氯仿法提取獲得細(xì)菌總DNA[11], 之后進(jìn)行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的完整性。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上已登錄的腸桿菌編碼dPGM的基因序列設(shè)計(jì)引物gpmA-1F(5′-ATGGCTGTAACTA AGCTGG-3′)和gpmA-751R(5′-TTACTTCGCTTTACC CTGA)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 編碼dPGM基因的克隆

以成團(tuán)泛菌BH-18總DNA為模板,gpmA-1F和gpmA-751R 為引物, PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL體系:10×Taq Buffer, 2.5 μL; dNTP Mixture(各2 mmol/L), 2 μL;引物(10 μmol/L)各0.5 μL; 模板DNA, 1μL; Taq酶(5 U/μL)(Solarbio), 0.2 μL; 加滅菌蒸餾水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃ 預(yù)變性 5 min; 94 ℃ 3 0 s, 49 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測, 用Bio-Rad Chemi-DocXRS凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3 編碼dPGM的基因序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒(Omega)回收后, 由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。通過軟件BLAST, 將該序列與相似的變位酶基因序列進(jìn)行比對。同時(shí), 根據(jù)推導(dǎo)出的氨基酸序列, 采用Bioedit和Mega4軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

1.4 dPGM 在產(chǎn)氫過程中轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)分析

1.4.1 成團(tuán)泛菌BH-18總RNA的提取

分別在成團(tuán)泛菌BH-18 產(chǎn)氫開始(A)、產(chǎn)氫2 h(B)、產(chǎn)氫4 h(C)、產(chǎn)氫6 h(D)、產(chǎn)氫8 h(E)和產(chǎn)氫結(jié)束(F)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取發(fā)酵液, 離心收集菌體, -80 ℃ 凍存用于RNA的提取。成團(tuán)泛菌BH-18總RNA通過RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取獲得。通過1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性, 通過測定A260/A280判斷RNA的濃度和純度。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已測定的成團(tuán)泛菌BH-18中編碼dPGM的基因序列, 設(shè)計(jì)引物gpmA-292F(5′- CTCAACAA AGCCGAAACCGC-3′)和gpmA-565R(5′- CAGGGAG TTACCGTGAGC G-3′)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 dPGM在產(chǎn)氫過程中轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)分析

以提取的成團(tuán)泛菌BH-18總RNA為模板, 根據(jù)說明, 用Promega的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈, 以此為模板, 用引物gpmA-292F和gpmA-565R,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增dPGM基因的cDNA片段。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL體系: 10×Taq Buffer, 2.5 μL;dNTP Mixture(各2 mmol/L), 2 μL; 引物(10 μmol/L)各0.5 μL; 模板cDNA, 0.5 μL; Taq (5 U/μL)(Solarbio),0.2 μL; 加滅菌蒸餾水至25 μL。然后按以下步驟進(jìn)行PCR 循環(huán): 94 ℃ 預(yù)變性 5 min; 94 ℃ 3 0 s, 53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL 經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用Bio-Rad ChemiDocXRS凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 編碼dPGM基因的克隆

圖1 成團(tuán)泛菌BH-18中編碼dPGM基因的克隆Fig.1 Clone of dPGM-encoding gene in Pantoea agglomerans

PCR擴(kuò)增獲得兩條帶(圖1), 片段大小分別約為750bp和500bp。其中750bp與文獻(xiàn)中報(bào)道的編碼dPGM的基因大小一致[12-13], 所以初步確定該條帶為目的片段。但是由于該條帶較弱, 故回收純化后進(jìn)行二次擴(kuò)增, 以獲得高純目的基因。

2.2 編碼dPGM基因的測序結(jié)果

將大小約為750 bp的條帶大量擴(kuò)增, 純化該條帶后送該條帶到華大基因進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果表明該基因整個(gè)開放閱讀框ORF為753bp, 編碼250aa, 序列(GenBank登錄號(hào): JX156332)見圖2。

2.3 編碼dPGM的基因序列分析

測序結(jié)果用軟件BLAST將該序列與相似的變位酶基因序列進(jìn)行比對。結(jié)果表明該基因保守性相對較高, 與腸桿菌科的眾多菌株中的dPGM基因相似性100%, 這也與之前的報(bào)道相符[13]。采用Bioedit和Mega4軟件成功構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果表明成團(tuán)泛菌BH-18的dPGM氨基酸序列與Enterobacter asburiae的dPGM聚為一類, 而與成團(tuán)泛菌屬菌株的相應(yīng)蛋白關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。由此表明, dPGM的氨基酸序列在屬內(nèi)不保守。

2.4 成團(tuán)泛菌BH-18總RNA的提取結(jié)果

圖2 成團(tuán)泛菌BH-18中編碼dPGM基因完整開放閱讀框及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The complete open reading frame of dPGM-encoding gene and the deduced amino acid sequence of dPGM in Pantoea agglomerans BH-18

圖3 成團(tuán)泛菌BH-18 dPGM NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(基于氨基酸序列)Fig.3 The NJ phylogenetic tree of dPGM in Pantoea agglomerans BH-18, based on the amino acid sequences

如圖4所示, 成團(tuán)泛菌BH-18產(chǎn)氫不同階段提取的總RNA, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結(jié)果總RNA條帶清晰, 表明提取的總 RNA完整性較好, 沒有發(fā)生降解。經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析,A260/A280的比值為2.0,表明總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染。因此提取的總RNA完整性和質(zhì)量都較好, 可用于反轉(zhuǎn)錄及半定量分析。

圖4 產(chǎn)氫不同階段提取到的成團(tuán)泛菌BH-18 RNAFig.4 RNA extraction of Pantoea agglomerans BH-18 in different phases of hydrogen production

2.5 dPGM 在產(chǎn)氫過程中轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)分析

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖5, 圖5a是管家基因16s DNA在產(chǎn)氫不同階段的RT-PCR結(jié)果。由圖5a可知,管家基因在各個(gè)階段表達(dá)穩(wěn)定, 可以作為樣本的參照。圖5b是編碼dPGM基因在產(chǎn)氫不同階段的RT-PCR結(jié)果。由圖5b可知, 在產(chǎn)氫開始時(shí)編碼dPGM的基因未轉(zhuǎn)錄; 在產(chǎn)氫2 h和4 h時(shí)基因開始轉(zhuǎn)錄但轉(zhuǎn)錄量較低; 產(chǎn)氫6 h和8 h時(shí)轉(zhuǎn)錄量升高,其中產(chǎn)氫6 h時(shí)轉(zhuǎn)錄量達(dá)到最高; 產(chǎn)氫結(jié)束后, 該酶還有少量的轉(zhuǎn)錄。即酶的轉(zhuǎn)錄是伴隨著產(chǎn)氫而進(jìn)行的。

圖5 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 RT-PCR amplification results

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從成團(tuán)泛菌BH-18中克隆獲得了編碼dPGM的基因, 其ORF為753 bp, 編碼250 aa。通過BLAST軟件, 將編碼dPGM的基因與相似的變位酶基因序列進(jìn)行比對。結(jié)果表明該基因保守性較高, 與腸桿菌科眾多菌株中的dPGM基因相似性100%。之后又根據(jù)翻譯獲得的氨基酸序列, 采用Bioedit和Mega4軟件成功構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果表明dPGM的氨基酸序列在屬內(nèi)不保守, 但是與Enterobacter asburiaedPGM的氨基酸序列相似。最后, 采用RT-PCR的方法監(jiān)測成團(tuán)泛菌BH-18產(chǎn)氫過程中編碼dPGM的基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化, 發(fā)現(xiàn)酶的轉(zhuǎn)錄是伴隨著產(chǎn)氫而進(jìn)行的, 之前的研究[10]顯示產(chǎn)氫6 h和8 h是產(chǎn)氫速率較高的階段, 而在此階段該酶的轉(zhuǎn)錄量也增加, 這說明該基因的轉(zhuǎn)錄與產(chǎn)氫情況呈正相關(guān)。由此我們推斷, 依賴型磷酸甘油酸變位酶可能是成團(tuán)泛菌BH-18產(chǎn)氫過程中的關(guān)鍵酶之一。

成團(tuán)泛菌BH-18是一種抗逆性較強(qiáng)的高效產(chǎn)氫菌株。它具有生長條件簡單、耐氧、耐鹽等優(yōu)點(diǎn), 適合作為優(yōu)良的產(chǎn)氫工程菌株。成團(tuán)泛菌BH-18并不是在生長初期就產(chǎn)生氫氣, 接種的菌株直到對數(shù)生長期的后期才開始產(chǎn)生氫氣, 產(chǎn)氫時(shí)間長達(dá)12h, 而且氫氣并不是其生長代謝所必須的物質(zhì), 由此可見,氫氣是成團(tuán)泛菌BH-18的次級(jí)代謝產(chǎn)物。同時(shí), 整個(gè)產(chǎn)氫過程一直處于厭氧的環(huán)境下, 而一般微生物在厭氧環(huán)境中, 需要進(jìn)行糖酵解作用來提供生命活動(dòng)所需要的能量, 因此, 糖酵解作用與成團(tuán)泛菌發(fā)酵產(chǎn)氫密切相關(guān), 而通過調(diào)控糖酵解作用來提高氫氣產(chǎn)量將是一個(gè)新的研究方向。磷酸甘油酸變位酶是糖酵解作用中的一個(gè)重要酶, 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中把敲除編碼磷酸甘油酸變位酶的基因或阻斷其表達(dá)作為控制腫瘤生長的新思路[14], 而在微生物制氫方面, 目前沒有相關(guān)的報(bào)道, 但本文研究發(fā)現(xiàn)dPGM的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上與產(chǎn)氫情況呈正相關(guān), 這一發(fā)現(xiàn)表明該酶可能是產(chǎn)氫的關(guān)鍵酶之一, 或許可以通過dPGM來調(diào)控糖酵解作用, 進(jìn)而影響氫氣的產(chǎn)生。即便這一設(shè)想不能實(shí)現(xiàn), 也可以為深入研究糖酵解作用與產(chǎn)氫過程的相關(guān)性及基因工程改造獲得高效產(chǎn)氫菌株提供理論依據(jù)。

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