4個(gè)縊蟶群體遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析

劉 博, 邵艷卿, 王 侃, 滕爽爽, 柴雪良, 方 軍, 張炯明, 肖國(guó)強(qiáng)

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 溫州325001)

縊蟶(Sinonovacula ConstrictaLamarck)俗稱蟶子, 屬軟體動(dòng)物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia)竹蟶科(solenidae)縊蟶屬(sinonovacula)貝類。縊蟶為廣溫廣鹽性海產(chǎn)雙殼類, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一?？O蟶養(yǎng)殖歷史悠久,過(guò)去主要集中在福建和浙江一帶, 隨著縊蟶養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)展, 山東、天津沿海地區(qū)開(kāi)始從福建、浙江等地區(qū)引進(jìn)苗種。浙江沿海為了能提早出苗, 每年9月份也大量從廣東湛江和福建云霄等地購(gòu)買親貝催產(chǎn)育苗。無(wú)序的養(yǎng)殖、盲目引種、移養(yǎng)等使溢蟶種質(zhì)資源混淆不清。因此, 分析不同地理群體遺傳結(jié)構(gòu)及種群間關(guān)系, 對(duì)縊蟶種質(zhì)資源合理保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用具有重要指導(dǎo)意義。

微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)與其他分子標(biāo)記相比, 具有多態(tài)性高、多等位性、共顯性、可重復(fù)性高、數(shù)量豐富和對(duì)基因組有很好的覆蓋性等特點(diǎn)[1], 被廣泛的用于種質(zhì)資源及品種(系)鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子標(biāo)記輔助選擇等多方面的研究[2]。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在太平洋牡蠣(Crassosttea Gigas)[3]、蝦夷扇貝[4-5]、文蛤[6-8]、皺紋盤鮑(Haliotis discushanna)[9]等已有報(bào)道, 關(guān)于縊蟶在遺傳多樣性和遺傳分化的研究已有線粒體COⅠ標(biāo)記法, RAPD和同工酶標(biāo)記等[10-12]; 目前, 縊蟶微衛(wèi)星方面的研究?jī)H局限在標(biāo)記開(kāi)發(fā)[13,14]和單一養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析[15], 而關(guān)于用微衛(wèi)星標(biāo)記分析不同地理居群縊蟶遺傳多樣的報(bào)道至今還沒(méi)有,本文首次利用SSR標(biāo)記分析了4個(gè)縊蟶居群的遺傳結(jié)構(gòu), 在分子水平上探討了處于不同地理區(qū)域的縊蟶群體遺傳多樣性差異和遺傳分化水平, 為其種質(zhì)資源管理和遺傳育種工作提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用4個(gè)縊蟶養(yǎng)殖群體, 于2011年9月分別采自福建云霄、廣東湛江、天津塘沽及浙江樂(lè)清灣, 各群體隨機(jī)取樣30顆, 活體解剖取其水管、斧足放入無(wú)水乙醇固定保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 DNA提取

基因組 DNA的提取采用常規(guī)的蛋白酶K消化,苯酚、氯仿/異戊醇抽提, 無(wú)水乙醇沉淀的方法, 提取縊蟶肌肉組織的基因組 DNA, 用 TE緩沖液稀釋至終濃度100 ng/μL用于實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物來(lái)自己發(fā)表的12對(duì)縊蟶引物序列(見(jiàn)表 1)[15]。PCR 反應(yīng)體系為 15 μL, 包括 10×PCR buffer 1.5 μL, 25 mmol/L Mg2+1.5 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL, 10 μmol/L 上下游引物各 1.5 μL, Taq 酶(5U)0.075 μL, DNA 模板1.5 μL, 加滅菌雙蒸水至15 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃條件下變性5 min后, 進(jìn)入30個(gè)PCR循環(huán): 在94℃下變性30 s, 復(fù)性(溫度見(jiàn)表1)30 s, 72 ℃下延伸45 s, 再最后72 ℃下延伸7 min,并將產(chǎn)物于4℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè), 鑒定有擴(kuò)增產(chǎn)物后再用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè), 銀染。

表1 12個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星引物序列Tab. 1 Primers sequences for the 12 polymorphic loci

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳圖譜, 并參照引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期片段的大小統(tǒng)計(jì)條帶, 應(yīng)用 POPGENE32軟件計(jì)算微衛(wèi)星引物的期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、觀測(cè)雜合度(Ho)、哈代-溫伯格平衡值(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)、FST、FIS及FIT等參數(shù)。根據(jù)遺傳距離利用 MEGA4.0軟件構(gòu)建 UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。多態(tài)信息含量(Polymorphic information content,PIC)的計(jì)算公式如下:

其中,Pi,Pj是某個(gè)位點(diǎn)第i、j個(gè)等位基因的基因頻率,n為某個(gè)位點(diǎn)上的等位基因數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 四個(gè)縊蟶群體的微衛(wèi)星等位基因及多樣性分析

12對(duì)引物共檢測(cè)出 46個(gè)等位基因, 其中YC30位點(diǎn)等位基因數(shù)目最多為12個(gè), 表現(xiàn)為高度多態(tài); 每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)從2～12個(gè)不等, 平均每個(gè)位點(diǎn)觀測(cè)等位基因數(shù)目為 3.83; 有效等位基因數(shù)從位點(diǎn) YC8的 1.65到位點(diǎn) YC30的 9.75, 平均有效等位基因數(shù)為3.03; 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在130～180 bp之間。

2.2 四個(gè)縊蟶群體內(nèi)遺傳變異

4個(gè)縊蟶群體的等位基因數(shù)(Ao)、有效等位基因數(shù)(Ae)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)及 Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。4個(gè)縊蟶群體的遺傳差異較小, 平均等位基因數(shù)Ao在3.25～3.50, 有效等位基因數(shù)Ae在 2.57～2.69, 等位基因數(shù)最低的是天津縊蟶群體, 最高的是福建縊蟶群體, 平均值為 2.69。平均多態(tài)信息含量(PIC)在0.46～0.50之間, 以福建群體最高為0.50。群體觀測(cè)雜合度Ho在 0.59～0.74之間, 最高的為天津群體,最低的為福建群體; 而4個(gè)群體的期望雜合度(He)差異不大, 在 0.55～0.58之間, 最高的是福建群體為0.58。Hardy- Weinberg平衡檢驗(yàn)表明, 除福建云霄群體有4個(gè)位點(diǎn)偏離平衡外, 廣東湛江群體、天津塘沽群體和浙江樂(lè)清灣群體中的大部分微衛(wèi)星位點(diǎn)都偏離了Hardy- Weinberg平衡(表2)。

表2 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在4個(gè)縊蟶群體中的遺傳多樣性及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab. 2 Genetic diversity and Hardy-Weinberg in four strains of S. constricta for the 12 polymorphic loci

2.3 不同縊蟶群體間遺傳分化

應(yīng)用Popgene32軟件對(duì)4個(gè)縊蟶群體進(jìn)行了F-統(tǒng)計(jì)量及基因流分析, 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知, 4個(gè)縊蟶群體僅有 3個(gè)位點(diǎn) YC8、YC12和 YC30的F-統(tǒng)計(jì)量為正值, 其余9個(gè)位點(diǎn)均為負(fù)值,Fis平均值為-0.21,Fit平均值為-0.31; 度量群體間遺傳差異程度的Fst平均值為0.07。遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)分析不同群體的遺傳分化情況, 發(fā)現(xiàn)縊蟶群體除了YC11、YC20、YC27與YC30等4個(gè)基因座固定指數(shù)小于0.05, 其余均大于種間無(wú)遺傳分化的標(biāo)準(zhǔn)(Fst=0～0.05)[16], 基因流Nm平均值為3.33。

利用 MEGA4分析軟件, 采用非加權(quán)的組平均法(UPGMA)對(duì) 4個(gè)群體進(jìn)行聚類分析, 獲得聚類樹(shù)系圖(圖1), 4個(gè)縊蟶群體之間的Nei’s遺傳距離和遺傳相似度見(jiàn)表 4。4個(gè)縊蟶群體共分為 2大支系:浙江樂(lè)清灣群體和天津塘沽群體之間的遺傳距離最小為 0.0344, 聚為第一支; 福建云霄群體和廣東湛江群體之間的遺傳距離為0.103, 聚為第二支。

表3 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的固定指數(shù)及基因流Tab. 3 Fixation index and gene flow of 12 polymorphic loci

表4 Nei遺傳相似度和遺傳距離Tab. 4 Nei genetic similarity and genetic distance

圖1 根據(jù)群體間遺傳距離用UPGMA法構(gòu)建了4個(gè)泥蚶群體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree based on genetic distance of 4 four strains of S. constricta by UPGMA assay

3 討論

3.1 縊蟶群體內(nèi)遺傳多樣性

依據(jù)PIC判斷標(biāo)準(zhǔn):PIC＜0.25為低度多態(tài), 0.25≤PIC＜0.5為中度多態(tài),PIC≥0.5為高度多態(tài)[17], 可以看出本研究的 4個(gè)縊蟶群體的平均多態(tài)信息含量(PIC)基本一致在 0.46～0.50之間, 相差無(wú)幾且接近于0.5, 表明4個(gè)縊蟶群體的遺傳多樣性處于中等偏上水平, 4個(gè)群體未出現(xiàn)明顯的種質(zhì)退化。

李成華等[18]和王冬群等[12]分別利用RAPD技術(shù)和同工酶技術(shù)分析了不同地理群體的野生縊蟶群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性, 野生群體的遺傳多樣性略高于養(yǎng)殖群體, 但與本實(shí)驗(yàn)相比, 以上各群體的遺傳多樣性明顯低于本研究中 4個(gè)群體的, 分析原因主要與各實(shí)驗(yàn)采用的標(biāo)記類型不同有關(guān)。顯性標(biāo)記RAPD與共顯性標(biāo)記SSR相比, 其無(wú)法區(qū)分顯性純合子和雜合子, 其多態(tài)信息含量?jī)H是 SSR的 1/2;而 England等[19]通過(guò)對(duì)同工酶和微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性的比較發(fā)現(xiàn), 同一群體的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)為5.2個(gè), 同工酶為 3.0個(gè), 因此不同類型標(biāo)記影響了對(duì)群體遺傳多樣性的分析。本研究中以天津群體的觀測(cè)雜合度最高, 但從 4個(gè)縊蟶群體的平均等觀測(cè)位基因數(shù)Ao來(lái)看, 天津群體的平均值最低為 3.25,等位基因數(shù)目最少, 基因型單一, 原因可能是這些基因型對(duì)環(huán)境的適應(yīng)度較高, 經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的遺傳漂變和適應(yīng)性選擇逐漸呈現(xiàn)出了高的基因頻率, 進(jìn)而產(chǎn)生了與其他地區(qū)群體不同的遺傳結(jié)構(gòu)[20]。

3.2 縊蟶群體間的遺傳分化

群體Fst值在 0～0.05之間, 則表明其各亞群間不存在分化; 若Fst值在 0.05～0.15之間, 為中度分化; 若Fst值在 0.15～0.25之間, 則為高度分化。本研究結(jié)果群體間遺傳差異程度的Fst=0.07, 表明4個(gè)縊蟶群體間的遺傳變異為 7.0%, 而 93.0%為群體內(nèi)的遺傳變異, 兩者比例懸殊, 說(shuō)明所選4個(gè)縊蟶群體間的變異絕大部分來(lái)自群體內(nèi), 群體間的遺傳分化程度不高, 而且這種差別也未影響到遺傳水平。

固定指數(shù)Fis是檢驗(yàn)群體雜合子缺失或過(guò)剩的指標(biāo),群體內(nèi)固定指數(shù)Fis＞0時(shí), 表示品系內(nèi)存在較嚴(yán)重的近交現(xiàn)象, 導(dǎo)致雜合子缺失;Fis＜0時(shí), 存在遠(yuǎn)交現(xiàn)象, 有雜合子過(guò)剩。本研究中發(fā)現(xiàn)12個(gè)位點(diǎn)中有9個(gè)位點(diǎn)存在雜合子過(guò)?，F(xiàn)象, 并且平均Fis=-0.21, 表示群體內(nèi)并無(wú)明顯的近交現(xiàn)象。一般認(rèn)為雜合子過(guò)剩情況多的出現(xiàn)在研究對(duì)象為相對(duì)小的群體或者封閉群體, 如養(yǎng)殖群體中的子代群體往往由于親本數(shù)量所限, 奠基者效應(yīng)(Founder effect)會(huì)導(dǎo)致連鎖不平衡現(xiàn)象, 繼而造成雜合子過(guò)剩。分析本實(shí)驗(yàn)所出現(xiàn)的雜合子過(guò)剩的現(xiàn)象,可能與實(shí)驗(yàn)的樣本量較小有關(guān)系。

當(dāng)雜合子嚴(yán)重過(guò)剩即Fis明顯偏離0時(shí), 往往會(huì)引起群體顯著地偏離Hardy-Weinberg平衡。本次研究中福建云霄群體、廣東湛江群體、天津塘沽群體和浙江樂(lè)清灣群體的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中分別有4、7、7和8個(gè)位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡。這種現(xiàn)象在其他海水貝類, 如類海灣扇貝[21]、櫛孔扇貝[22]中也普遍存在。本研究中的4個(gè)縊蟶群體均處于不平衡狀態(tài), 這可能與群體間的無(wú)序養(yǎng)殖、遷移有關(guān)。浙江樂(lè)清灣是一個(gè)相對(duì)封閉的海灣, 但近年來(lái)人工育苗中, 為了提早培育出苗, 每年9至10月份都會(huì)從廣東、福建等地大量采購(gòu)親貝進(jìn)行人工繁殖, 而培育出的苗種除部分在本地中培和養(yǎng)殖外, 其余的又重新銷往福建、廣東、天津、遼寧等地, 因此遷移造成了對(duì)基因型的影響, 可能是導(dǎo)致這種不平衡的主要原因。

3.3 縊蟶群體間遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

遺傳距離是研究物種遺傳多樣性的基礎(chǔ), Crawford等[23]指出由微衛(wèi)星得出的遺傳距離更能反映分化時(shí)間的長(zhǎng)短, 能客觀地反映品種間的遺傳變異和分化。本研究中, 浙江樂(lè)清灣群體和天津塘沽群體之間的遺傳距離最小為 0.0344, 聚為第一支; 福建云霄群體和廣東湛江群體之間的遺傳距離為 0.103, 聚為第二支。聚類結(jié)果與牛東紅[24]利用ISSR標(biāo)記對(duì)6個(gè)野生縊蟶群體的聚類結(jié)果差異較大, 并未表現(xiàn)出遺傳距離和地理距離之間的正相關(guān)。出現(xiàn)這種情況可能與近年來(lái)縊蟶無(wú)序養(yǎng)殖有關(guān), 福建、廣東、浙江等沿海存在相互間盲目引種和移養(yǎng)的現(xiàn)象, 造成縊蟶資源混亂并使本土自然資源混淆不清, 目前已經(jīng)很難找到未受人為因素干擾的野生縊蟶群體了。另外, 聚類結(jié)果的差異, 也可能與采用的分子標(biāo)記類型不同有關(guān)。

3.4 縊蟶種質(zhì)資源的保護(hù)與開(kāi)發(fā)策略

由于本研究中的 4個(gè)群體均來(lái)源自當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖群體, 可能已經(jīng)受到了外來(lái)縊蟶群體的污染, 不能充分代表當(dāng)?shù)匾吧O蟶種質(zhì)資源狀況, 因此建議在做好對(duì)當(dāng)?shù)卦家吧O蟶資源收集的情況下, 利用不同分子標(biāo)記技術(shù)分析各地野生縊蟶原種間及野生原種和人工養(yǎng)殖群體的遺傳差異, 根據(jù)主要遺傳差異來(lái)源的不同(群體間還是群體內(nèi)), 制定合理的保種策略。

針對(duì)本研究 4個(gè)縊蟶群體的變異絕大部分來(lái)自群體內(nèi), 群體間的遺傳分化程度不高的情況, 筆者認(rèn)為可以采取如下保種和開(kāi)發(fā)的措施: (1)采取原位保存的措施, 通過(guò)建立原種場(chǎng)和自然保護(hù)區(qū)等方法加強(qiáng)野生原種的保護(hù), 避免外來(lái)縊蟶群體對(duì)原種的污染。(2)由于4個(gè)群體的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi),說(shuō)明合理有序的引種不會(huì)帶來(lái)不利的遺傳效應(yīng)[25],因此, 在正確收集和保護(hù)好野生原種的基礎(chǔ)上, 可以適當(dāng)引進(jìn)其他地理群體的優(yōu)質(zhì)縊蟶種質(zhì)來(lái)提高當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源的生產(chǎn)率。

[1]Powell W, Machray G C, Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J]. Trends Plant Science, 1996, 1: 215-222.

[2]Zane L, Bargelloni L, Patamello T. Strategies for microsatellites isolation: a review [J]. Molecular Ecology, 2002, 11: 1-16.

[3]李琪, 木島明博.長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)微衛(wèi)星克隆快速分離及特性分析[J].海洋與湖沼, 2004, 35(2):364-370.

[4]趙瑩瑩, 朱曉琛, 孫效文, 等.磁珠富集法篩選蝦夷扇貝微衛(wèi)星序列[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2006, 13(5):749-755.

[5]李春艷, 丁君, 常亞青, 等. 蝦夷扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的分離及其養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16( 1): 39-46.

[6]Lu X, Wang H X, Liu B Z, et al. Microsatellite-based genetic and growth analysis for a diallel mating design of two stocks of the clam,Meretrix meretrix[J]. Aquaculture Research, 2011: 15-18.

[7]朱東麗, 董迎輝, 林志華, 等. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)文蛤 4個(gè)殼色花紋品系的遺傳分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012,36(2): 202-209.

[8]陳淑吟, 吉紅九, 許廣平, 等. 文蛤微衛(wèi)星 DNA 的篩選及其特性分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, 12:134-138.

[9]李莉, 孫振興, 楊樹(shù)德, 等. 用微衛(wèi)星標(biāo)記分析皺紋盤鮑群體的遺傳變異[J]. 遺傳, 2006, 28(12):1549-1554.

[10]牛東紅, 陳慧, 王樹(shù)亮, 等. 我國(guó)沿?？O蟶居群遺傳結(jié)構(gòu)的mtDNA-COⅠ分析[J]. 動(dòng)物學(xué)雜, 2010, 45(2): 11-18.

[11]于穎, 孟祥盈, 王秀利, 等. 縊蟶遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2007, 6:138-143.

[12]王冬群, 李太武, 蘇秀榕, 等. 象山縊蟶養(yǎng)殖居群和野生居群遺傳多樣性的比較[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2005,12(2):138-143.

[13]Niu D H, Li J L, Liu B D. Polymorphic microsatellite loci for population studies of the razor clamSinonovacula constricta[J].Convser Genet, 2008, 9: 1393-1394.

[14]劉 博, 滕爽爽、邵艷卿, 等. 縊蟶(Sinonovacula constricta)EST-SSR分布特征及引物開(kāi)發(fā)利用[J].海洋與湖沼, 2012, 43(1):132-137.

[15]劉博, 邵艷卿, 滕爽爽, 等. 樂(lè)清灣養(yǎng)殖縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(2):69-73.

[16]Strauss W M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. (In): Ausubel F.M, Brent R, Kingston R E, eds. Current protocol in molecular biology[M]. New York, John Wiley and Sons, 1989, 221-222.

[17]Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet,1980, 32:314-331.

[18]李成華, 李太武, 宋林生, 等. 4個(gè)縊蟶群體遺傳結(jié)構(gòu)的RAPD分析[J].水產(chǎn)科學(xué), 2004,23(12):26-28.

[19]England P R, Briscoe D A, Frankham R. Microsatellite polymorphisms in a wild population of Drosophila melanogaster[J]. Genetical Research, 1996(67): 285-290.

[20]游翠紅, 童金茍, 俞小牧. 大鱗副泥鰍 7個(gè)群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].水生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 33 (1):84-91.

[21]Zhan A B, Hu J J, Wang X L, et al. A panel of polymorphic EST-derived microsatellite loci for the bay scallop (Argopecten irradians)[J]. Journal of Molluscan Studies, 2006, 72(4): 436-439.

[22]戰(zhàn)愛(ài)斌, 胡景杰, 胡曉麗, 等. 富集文庫(kù)-菌落原位雜交法篩選櫛孔扇貝的微衛(wèi)星標(biāo)記[ J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008,32(3): 353-361.

[23]Crawford A M, Littlepohn R P. The use of DNA marker in deciding conservation priorities in sheep and other livestock[J]. Animal Genetic Resources Information,1998, 23(1): 21-26.

[24]牛東紅, 李家樂(lè), 馮冰冰, 等. 縊蟶 6個(gè)群體遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2009, 15(3):332-336.

[25]Rossetto M, Weaver P K, Dixon K W. Use of RAPD analysis in devising conservation strategies for the rare and endangeredGrevillea scapigera(Proteaceae)[J].Molecular Ecology, 1995, 4: 321-329