長牡蠣中國群體與日本群體雜交子一代的生長和存活比較

孔令鋒, 滕爽爽, 李 琪

(中國海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

長牡蠣(Crassostrea gigas), 俗稱太平洋牡蠣,是世界性的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類[1]。長牡蠣的產(chǎn)量在世界所有漁業(yè)和養(yǎng)殖的貝類種類中位居首位, 2010年全球產(chǎn)量達(dá) 66萬噸, 產(chǎn)值約 12.6億美元[2]。在我國, 長牡蠣大規(guī)模的人工育苗與養(yǎng)殖始于20世紀(jì)70年代末和80年代初, 目前遼寧、山東、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等沿海地區(qū)已成為長牡蠣的主要養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū), 2010年全國牡蠣的總產(chǎn)量超過364萬噸, 占我國貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的32.9%[3], 取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。近年來, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大, 長牡蠣的產(chǎn)量大幅度提高, 但品質(zhì)卻在下降, 種質(zhì)也出現(xiàn)退化, 表現(xiàn)出出肉率低下、形態(tài)不規(guī)則、肉質(zhì)不好等缺點(diǎn)[4-5], 因此, 市場價(jià)格偏低, 達(dá)不到牡蠣活體出口標(biāo)準(zhǔn), 嚴(yán)重影響了牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康、穩(wěn)定和持續(xù)發(fā)展。雖然通過改善生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)能夠使上述問題得到一定程度的解決, 但從長遠(yuǎn)上, 還需要深入研究牡蠣的種質(zhì)資源, 培育出產(chǎn)量高、品質(zhì)好的長牡蠣優(yōu)良品種。

雜交育種是遺傳育種的主要手段之一, 是改良遺傳性狀、培育優(yōu)良品種的可靠途徑。雜交育種的主要目的是獲得雜種優(yōu)勢, 由于雜種優(yōu)勢和雜種活力的存在, 雜交能迅速和顯著地提高雜種的產(chǎn)量和生活力[6-7]。因此雜交育種廣泛應(yīng)用在動植物的種質(zhì)改良中[8-11], 并且在水產(chǎn)動物的品種改良和生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用[12]。

近年來, 許多研究報(bào)道了貝類群體間雜交的結(jié)果。不同群體雜交的子代在生長、存活和生產(chǎn)性能等方面的表現(xiàn)都優(yōu)于其親本的自繁群體。Cruz等[13]對扇貝(Argopecten circularis)的兩個(gè)群體進(jìn)行了雜交實(shí)驗(yàn), 他們發(fā)現(xiàn)在幼蟲初期殼長生長存在明顯的母體效應(yīng), 在第15天后存在一定的雜種優(yōu)勢。劉小林等[14]進(jìn)行了櫛孔扇貝中國群體和俄羅斯群體的雜交實(shí)驗(yàn), 對雜交后代和親本群體后代進(jìn)行了比較, 發(fā)現(xiàn)雜交后代在殼高、殼長、殼寬和活體質(zhì)量 4個(gè)生長發(fā)育指標(biāo)上均表現(xiàn)不同程度的雜種優(yōu)勢。Zhang等[15]開展了海灣扇貝加拿大群體和墨西哥灣群體的雜交實(shí)驗(yàn)工作, 對雜種一代及對照群體的生長和存活進(jìn)行了比較, 在第 10天后, 兩個(gè)雜交組的殼長顯著大于兩個(gè)對照群體, 體現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢。但有關(guān)牡蠣不同群體或亞種間的雜交還少有報(bào)道。Newkirk等[16]和Newkirk[17]報(bào)道了美洲牡蠣C. virginica4個(gè)種群雜交后代在存活率和生長方面優(yōu)于親本。Stiles[18]利用C. virginica不同地理種群以及與C. gigas進(jìn)行了雜交, 結(jié)果表明不同地理種群間雜交后代幼體的存活率和生長速度都比種間雜種要高。

為了探索利用雜交培育長牡蠣優(yōu)良養(yǎng)殖新品種的可行性, 本研究利用長牡蠣中國群體和日本群體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn), 比較不同雜交組與對照組幼蟲、稚貝及養(yǎng)成期的生長、存活, 研究雜交組是否存在雜種優(yōu)勢, 進(jìn)而為長牡蠣的雜交育種提供理論依據(jù), 為長牡蠣雜交的生產(chǎn)實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

長牡蠣中國群體為2007年群體選育F1子代, 日本群體為2007年群體選育F1子代。實(shí)驗(yàn)于2008年5月在山東省文登市水產(chǎn)綜合育苗試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用長牡蠣中國群體與日本群體進(jìn)行 4個(gè)組合的雜交與自交試驗(yàn), 雜交實(shí)驗(yàn)組: 長牡蠣中國群體♀ × 長牡蠣日本群體♂(C♀ × J♂, CJ), 長牡蠣日本群體♀ × 長牡蠣中國群體♂(J♀ × C♂, JC),自交實(shí)驗(yàn)組: 長牡蠣中國群體♀ × 長牡蠣中國群體♂(C♀ × C♂, CC), 長牡蠣日本群體♀ × 長牡蠣日本群體♂(J♀ × J♂, JJ)。實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)重復(fù)。

1.3 人工授精, 孵化及幼蟲培育

從每個(gè)群體中選擇雌雄各10個(gè)性腺發(fā)育完全成熟的個(gè)體。采用解剖法收集卵子, 在盛有10 L, 24℃海水的小桶中促熟, 將長牡蠣中國群體10個(gè)雌性個(gè)體的卵子充分混合; 同樣操作獲得混合的長牡蠣中國群體精子, 長牡蠣日本群體卵子和長牡蠣日本群體精子。再把兩個(gè)群體的卵子等份分開, 每一群體的卵子分別與群體內(nèi)或群體間的精子授精。得到四個(gè)交配組合 C♀ × C♂, C♀ × J♂, J♀ × C♂, J♀ × J♂。

孵化時(shí)持續(xù)微充氣, 并每隔 1～2 h 攪拌一次,以防止受精卵的堆積。受精后24 h, 受精卵發(fā)育到D形幼蟲。將每個(gè)交配組合的幼蟲分別選幼至 100 L聚乙烯桶中培育, 設(shè) 3組重復(fù), 初始 D形幼蟲密度10個(gè)/mL, 水溫控制在 23～24℃, 持續(xù)充氣, 每天換水一次, 換水量1/3。隨著幼蟲長大, 增大換水量, 到面盤幼蟲后期, 日換水量 1/2, 所用海水經(jīng)過砂濾處理。餌料以等邊金藻(Isochrysis galbana)為主, 后期輔助投喂扁藻(Platymonassp.), 牟氏角毛藻(Chaetoceros muslleri), 投餌量根據(jù)幼蟲的攝食情況和水中殘餌情況確定。各實(shí)驗(yàn)組投餌、換水、充氣等操作一致。所用試驗(yàn)器具都在淡水中浸泡 5 min,以殺死殘留在網(wǎng)上的幼蟲, 以防混雜污染, 各試驗(yàn)組之間嚴(yán)格避免相互混雜。

1.4 稚貝中間培育及養(yǎng)成

大約 22 d后, 幼蟲開始陸續(xù)出現(xiàn)眼點(diǎn), 當(dāng)30%左右的幼蟲出現(xiàn)眼點(diǎn)時(shí), 開始投放附著基。在室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 15 d后, 掛到室外在沉淀池暫養(yǎng), 確認(rèn)自然海區(qū)無野生牡蠣浮游幼蟲污染后, 轉(zhuǎn)至文登市東港海上籠式浮筏懸掛養(yǎng)殖。各實(shí)驗(yàn)組的放養(yǎng)密度、水層深度等環(huán)境條件均保持一致。養(yǎng)成期間, 每隔2月將籠取回, 剔出籠上附著生物, 觀察生長情況, 并逐漸疏散密度。

1.5 分析的性狀、取樣及測量

分析的性狀包括: (1)受精率; (2)孵化率; (3)幼蟲期, 殼高、殼長和存活率; (4)稚貝和養(yǎng)成期, 殼高、殼長和存活率。

受精率(%)= 出現(xiàn)第一極體的卵子/所有卵子 ×100;

孵化率(%)= 孵化出的D形幼蟲/受精卵 × 100;

幼蟲期存活率(%)= 測量日存活的幼蟲/第1天的幼蟲 × 100;

稚貝養(yǎng)成期存活率(%)= 測量日存活的稚貝/第60天的稚貝 × 100;

幼蟲期, 在第1, 5, 10, 15, 20, 25天取樣, 每組每次取樣30個(gè)體, 用盧戈氏液殺死固定, 在100 ×的顯微鏡下, 用目微尺測量測量其殼高、殼長; 稚貝和養(yǎng)成期, 在第60, 100, 150, 210, 280天, 各實(shí)驗(yàn)組取樣30個(gè), 用游標(biāo)卡尺(精度0.02 mm)測量殼高、殼長。

1.6 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算雜交子代各性狀的雜種優(yōu)勢率(H, Heterosis), 公式為:

式中,F1為雜交子代性狀的平均值,P為兩自交組子代性狀的平均值[19]。

用EXCEL軟件統(tǒng)計(jì)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間在不同階段各性狀指標(biāo)的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差, 并采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及Tukey’s多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 受精率、孵化率的比較

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的受精率變化范圍為 76.76%～91.33%,其中JC組的受精率最低, 為76.76%, CJ組的受精率最高, 為 91.33%, 自交組 CC和 JJ的受精率介于雜交組CJ和JC之間, 經(jīng)方差分析表明, 雜交組與自交組之間無顯著差異。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的孵化率變化范圍為71.25%～96.00%, 其中 CJ組的孵化率最低, 為71.25%, JJ組的孵化率最高, 為96.00%, 相同卵子來源的組合在孵化率上無差異, 即CC組與CJ組之間,JC組與JJ組之間無顯著差異(表1)。

2.2 幼蟲期生長、存活以及雜種優(yōu)勢率的比較分析

2.2.1 幼蟲期殼高、殼長的比較分析

本雜交實(shí)驗(yàn)中, 幼蟲期自 1 d起, 到投附著基,自交組JJ和雜交組JC的殼高始終大于自交組CC和雜交組CJ, 經(jīng)方差分析表明, JJ組和JC組之間, CC組和 CJ組之間無顯著差異(P＞0.05), 即相同卵子來源的組合在殼高上無差異; 而 JJ、JC與 CC、CJ各組之間差異顯著(P＜0.05)。到了25 d, JJ組殼高最大,為 266.2 μm; 其次是 JC 組, 為 258.1 μm; CJ組為238.2 μm; CC 組殼高最小, 為 222.5 μm。幼蟲期間, 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的殼長生長趨勢與殼高相同, 即自交組 JJ和雜交組JC的殼長始終大于自交組CC和雜交組CJ。在25 d, JJ組生長最快, 殼長為241.9 μm; JC組殼長略微小于 JJ組, 為 237.7 μm; CJ組殼長 215.4 μm; CC組殼長最小, 僅為 195.7 μm(表 2)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組的受精率、孵化率比較Tab. 1 Comparison of fertilized rate and hatching rate of the four groups (%)

表2 幼蟲期各實(shí)驗(yàn)組幼蟲的殼高和殼長Tab. 2 Shell height and shell length of the four groups at larvae stage (μm)

2.2.2 幼蟲期存活率的比較分析

兩個(gè)自交組和雜交組幼蟲階段的存活率如表 3所示。在5～15 d, JC組和CC組的存活率明顯大于JJ組和CJ組; JC、CC和JJ、CJ各組之間差異顯著。15 d后, CC組和CJ組的存活率出現(xiàn)明顯下降, CC組的存活率由15 d的74.8%下降到20 d的25.6%, CJ組由53.5%下降到4.9%; 而JC組和JJ組存活率無明顯下降。到了25 d, 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的存活率均出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象, 方差分析表明, CC組和CJ組之間, JC組和JJ組之間無顯著差異。

2.2.3 幼蟲期雜種優(yōu)勢率的比較分析

幼蟲階段, 雜交組生長和存活的雜種優(yōu)勢率見表 4。同自交組相比, 雜交組 JC在殼高、殼長和存活率上均具有明顯的雜種優(yōu)勢, 并且在幼蟲生長階段, 雜交組JC的殼高、殼長和存活率的雜種優(yōu)勢率隨著生長逐漸增加。1～25 d, JC組殼高的雜種優(yōu)勢率為 0.85%～5.63%, 殼長的雜種優(yōu)勢率為 0.29%～8.64%,存活率的雜種優(yōu)勢率為12.31%～96.45%, 而CJ組則無雜種優(yōu)勢率。

表3 幼蟲期各實(shí)驗(yàn)組幼蟲的存活率Tab. 3 Percent survival means of the four groups at larvae stage (%)

表4 幼蟲期各雜交組生長和存活的雜種優(yōu)勢率Tab. 4 Heterosis for growth and survival of the four groups at larvae age

2.3 稚貝、養(yǎng)成期生長、存活以及雜種優(yōu)勢率的比較分析

2.3.1 稚貝、養(yǎng)成期殼高、殼長的比較分析

各實(shí)驗(yàn)組稚貝在60, 100, 150, 210和280日齡的殼高和殼長的生長變化見表5。CC, CJ, JC, JJ 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的殼高和殼長隨著日齡的增加均呈上升趨勢,280日齡時(shí)殼高分別為23.1, 29.6, 33.3, 37.4 mm, 殼長分別為17.6, 22.2, 26.8, 28.2 mm。在整個(gè)稚貝, 養(yǎng)成期, 雜交組CJ和JC的平均殼高、殼長均介于自交組CC和JJ之間, 到了280 d, 雜交組CJ、JC和自交組 CC、JJ在殼高和殼長上顯著差異(P＜0.05), 雜交組CJ和JC之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.3.2 稚貝, 養(yǎng)成階段存活率的比較分析

各實(shí)驗(yàn)組稚貝在100, 150, 210和280日齡的存活率變化見表6。CC, CJ, JC, JJ 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的存活率日齡的增加均呈下降趨勢, 280日齡時(shí)各實(shí)驗(yàn)組存活率分別為34.4, 12.2, 1.1, 1.1%。在整個(gè)稚貝, 養(yǎng)成期,CC組存活率最高, 其次是CJ組和JJ組, JC組存活率最低。JC組和 JJ組之間無顯著差異(P＞0.05), 但與CC組, CJ組之間差異顯著(P＜0.05)。

表5 稚貝, 養(yǎng)成期各實(shí)驗(yàn)組稚貝的生長Tab. 5 Growth of the four groups at spat and adult stage (mm)

表6 稚貝, 養(yǎng)成期各實(shí)驗(yàn)組稚貝的存活率Tab. 6 Percent survival means of the four groups at spat and adult stage (%)

2.3.3 稚貝, 養(yǎng)成階段雜種優(yōu)勢率的比較分析

表7 稚貝, 養(yǎng)成期各雜交組生長和存活的雜種優(yōu)勢率Tab. 7 Heterosis for growth and survival of the four groups at spat and adult stage

稚貝, 養(yǎng)成期, 雜交組生長和存活的雜種優(yōu)勢率見表 7。同自交組相比, 雜交組 JC在殼高、殼長上均具有雜種優(yōu)勢, 并且雜交組JC在殼高上的雜種優(yōu)勢率隨著日齡的增加而增加(1.12%～13.80%), 殼長的雜種優(yōu)勢率亦是如此(1.55%～17.03%); 而JC在存活率方面的不具有雜種優(yōu)勢。雜交組CJ在殼高、殼長和存活率上都不具有雜種優(yōu)勢率。

3 討論

雜種優(yōu)勢是雜種子一代在生長力、繁殖力、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀上優(yōu)于雙親的一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。雜種優(yōu)勢的大小, 大多取決于雙親性狀間的相對差異和互補(bǔ)程度。在一定范圍內(nèi), 雙親的差異越大,往往雜種優(yōu)勢越強(qiáng); 反之, 越弱。本實(shí)驗(yàn)中采用的兩個(gè)長牡蠣群體, 是中國群體2007年群體選育F1子代與日本群體2007年群體選育F1子代, 兩個(gè)群體來自不同的地點(diǎn), 長期的養(yǎng)殖環(huán)境差異, 加上各自為群體選育 F1子代, 經(jīng)過了以生長率、體長和體重為指標(biāo)的連續(xù)歧化選擇, 這些因素必然導(dǎo)致期遺傳上存在差異。因此, 利用中、日兩個(gè)長牡蠣群體進(jìn)行雜交有可能產(chǎn)生較大的雜種優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn), 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的受精率為 76.76%～91.33%, 經(jīng)方差分析表明, 雜交組與自交組之間無顯著差異; 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的孵化率為71.25%～96.00%, 其中CJ組的孵化率最低, 為 71.25%, JJ組的孵化率最高,為 96.00%, 相同卵子來源的組合在孵化率上無差異,即CC組與CJ組之間, JC組與JJ組之間無顯著差異。這些結(jié)果表明了長牡蠣中國群體和日本群體雜交的可行性。其主要原因是中國長牡蠣群體與日本長牡蠣群體之間的親緣關(guān)系較近, 雙親異性配子之間的親和力較高, 因此正、反雜交的受精率均很高。

本實(shí)驗(yàn)中, 雜交組JC在幼蟲期的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)(殼高、殼長和存活率)均表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢, 其幼蟲階段殼高、殼長和存活率的雜種優(yōu)勢率分別為0.85%～5.63%, 0.29%～8.64%, 12.31%～96.45%; 到了稚貝養(yǎng)成階段, JC在殼高和殼長上仍具有明顯的雜種優(yōu)勢, 殼高和殼長的雜種優(yōu)勢率分別為 1.12%～13.80%, 1.55%～17.03%。雜交后代在生長存活等方面表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢在其他水產(chǎn)動物的雜交實(shí)驗(yàn)中也同樣得到證實(shí)。例如, Newkirk[17]的研究發(fā)現(xiàn)長牡蠣 4個(gè)群體雜交后代在生長性狀和存活率方面明顯高于親本。Rahman等[20]對兩種海膽進(jìn)行雜交, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交組12月齡的平均體重比自交組分別增加51.7%和48.4%。

雖然本實(shí)驗(yàn)中, 雜交組JC在幼蟲期的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)上和稚貝養(yǎng)成期的殼高、殼長這些生長性狀上表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢, 但是在稚貝養(yǎng)成期的存活率上卻表現(xiàn)出了不同的現(xiàn)象, 雜種優(yōu)勢為負(fù)值, 而雜交組CJ在幼蟲期和稚貝養(yǎng)成期的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)上都沒有表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。這種不同的生長階段表現(xiàn)出不同的雜種優(yōu)勢率, 以及正、反雜交后代在雜種優(yōu)勢上具有不同表現(xiàn)的現(xiàn)象在其他水產(chǎn)動物雜交實(shí)驗(yàn)中也有發(fā)現(xiàn)。Zhang等[15]對海灣扇貝不同群體(M和C)進(jìn)行雜交, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 幼蟲階段, 雜交組MC生長最快; 到了稚貝養(yǎng)成階段, 雜交組 CM 超過 MC, 在殼高、殼長和總重這些生長指標(biāo)上表現(xiàn)最好。Zheng等[21]在海灣扇貝不同地理群體(A和B)雜交效果研究中發(fā)現(xiàn)群體 A在幼蟲、稚貝以及成貝都獲得了較高的雜種優(yōu)勢率, 而群體 B的雜種優(yōu)勢率在各階段均為負(fù)值。正、反雜交后代在雜種優(yōu)勢上具有不同表現(xiàn), 其主要原因是環(huán)境和遺傳因素的共同作用[22]。在幼蟲期, 由于室內(nèi)培育的原因, 水質(zhì)、水溫、餌料等因素保持在較適宜的條件下, 水中敵害生物較少,這時(shí)幼蟲的存活率高低主要取決于幼蟲本身的遺傳特性。長牡蠣日本群體為選擇育種 F1代, 經(jīng)過一代選擇, 各種生長性狀優(yōu)良, 遺傳基礎(chǔ)優(yōu)秀, 而且在生物早期階段的生長與發(fā)育中, 母體效應(yīng)是一個(gè)非常重要的影響因素, 因而在幼蟲期JJ和JC組的殼高、殼長生長較快, 存活率較高; 而長牡蠣中國群體取自威海乳山, 在中國養(yǎng)殖了多年, 種質(zhì)出現(xiàn)退化, 遺傳特質(zhì)上不如長牡蠣日本群體, 因而CC和CJ組生長緩慢, 存活率較低。到了稚貝及養(yǎng)成期, 海上養(yǎng)殖的環(huán)境條件不可控, 水溫、水質(zhì)、餌料, 敵害等環(huán)境因子隨著季節(jié)變化而變化, 使得環(huán)境條件對長牡蠣存活的影響非常大, 長牡蠣中國群體有可能更適應(yīng)中國水域的變化情況, 加上母體效應(yīng)即使成體之后依然存在的緣故[19], 因而使得CC和CJ的存活率較高, JJ和JC的存活率反而較低。

本實(shí)驗(yàn)通過對長牡蠣群體雜交的受精情況和雜種優(yōu)勢分析, 揭示了長牡蠣日本群體♀×中國群體♂的雜交子代在生長性狀方面具有顯著的雜種優(yōu)勢。所以, 應(yīng)用這兩個(gè)群體進(jìn)行雜交以改良現(xiàn)有養(yǎng)殖群體可能是一個(gè)有效的途徑。

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