季銨鹽聯(lián)吡啶－釕（Ⅱ）配合物的合成及其與小牛胸腺DNA的相互作用

陳嘉曦，郝洪慶，黃大坤，黃丹梅，林海玲，孫 靜＊

（1.廣東醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣東 東莞523808； 2.嘉應(yīng)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 梅州514015）

過渡金屬配合物與生物大分子DNA鍵合機(jī)理的研究有助于開發(fā)與基因突變有關(guān)的新治療藥物、DNA結(jié)構(gòu)探針等，成為生物無機(jī)化學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1－4］.其中釕（Ⅱ）配合物因具有多變的光物理、光化學(xué)等性質(zhì)以及在生物領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣大研究者的注意［5－6］.這些性質(zhì)與配合物的結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系，改變或者調(diào)節(jié)配體的結(jié)構(gòu)，如改變配體的平面性，平面的大小，配體的空間位阻以及增加配體的電荷能夠很大程度上影響甚至改變配合物的性質(zhì).在這些因素中，配體的電荷和空間位阻在配合物與DNA作用中，扮演著重要的角色.我們通過前期的研究發(fā)現(xiàn)［7］，在位阻變化不大的情況下加大配體的電荷，有助于增加配合物與DNA之間的靜電引力，從而增加它們之間的相互作用.三乙胺和三正丁胺配體“手臂”的尺寸較長，致使空間位阻過大而影響配合物的作用效果，因此我們選用三甲胺配體作為研究對象，減小配體的空間位阻，來研究配合物與DNA之間的作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

圖1 釕（Ⅱ）配合物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of the Ru（Ⅱ）complex

1.1 試劑和儀器

5，5′－二甲基－2，2′－聯(lián)吡啶購自Sigma－Aldrich公司，5，5′－二（溴甲基）－2，2′－聯(lián)吡啶以及配體5，5′－二（三甲銨基甲基）－2，2′－聯(lián)吡啶溴鹽 （LBr2·2H2O）的合成分別參照文獻(xiàn)［8－9］進(jìn)行；cis－Ru（phen）2Cl2·2H2O按照文獻(xiàn)［10］制備.CT－DNA購自Sigma－Aldrich公司，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）購自上海生工，其余均為市售分析純試劑，用前未做進(jìn)一步處理.配制緩沖溶液均用雙蒸水，實(shí)驗(yàn)所用緩沖溶液為兩種：（1）5mmol·L－1Tris和50mmol·L－1NaCl（pH＝7.2）的 Tris－HCl緩沖液；（2）1.5mmol·L－1Na2HPO4，0.5mmol·L－1NaH2PO4，0.25mmol·L－1Na2EDTA.紫外光譜、熒光光譜、CD（圓二色）光譜以及黏度等實(shí)驗(yàn)中的DNA母液，配合物母液及樣品的配制均在緩沖溶液（1）中進(jìn)行；熱變性實(shí)驗(yàn)的配合物母液、DNA母液及所有樣品的配制均在緩沖溶液（2）中進(jìn)行.

元素分析 （C、H、N）采用Elementar Vario EL元素分析儀測定；電子吸收光譜用Perkin Elmer Lambda850紫外分光光度計(jì)；熒光光譜用Perkin Elmer Ls55熒光光譜儀；CD譜采用JASCO－J810圓二色譜儀記錄.

1.2 配合物的合成

稱取cis－Ru（phen）2Cl2·2H2O（0.28g，0.5mmol）和配體5，5′－二（三甲銨基甲基）－2，2′－聯(lián)吡啶溴鹽（0.26g，0.5mmol）溶于乙二醇，在氬氣保護(hù)下130℃反應(yīng)4h，冷卻至室溫后加少量水稀釋，減壓抽濾去未反應(yīng)物，加入飽和NH4PF6溶液即產(chǎn)生大量紅色沉淀.抽濾，沉淀分別用水、乙醚洗滌數(shù)次后干燥.然后將干燥好的粗產(chǎn)品過色譜柱，得到較純的目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率72% .元素分析：實(shí)驗(yàn)值（%）：C 37.12，H 3.48，N 8.44；按C42H44N8P4Ru·H2O的計(jì)算值（%）：C 37.10，H 3.41，N 8.24.1H NMR（300MHz，d6－DMSO）：δ9.40（d，2H）；8.83（d，2H）；8.73（d，2H）；8.39（dd，6H）；8.30（t，2H）；7.90（dd，4H）；7.67（m，4H）；4.34（s，4H）；2.74（s，18H）.ES－MS：［CH3CN；m／z］＝1 197［M－PF－6］＋（60%），526［M－2PF－6］2＋（95%），302［M－3PF－6］3＋（100%）.

1.3 配合物與DNA作用的電子吸收光譜

在紫外－可見吸收光譜測定中，參比池放入3.0mL緩沖溶液，樣品池放置相同體積的10μmol·L－1配合物溶液.用移液器每次向參比池和樣品池同時加入相同體積DNA溶液，使DNA與配合物濃度比值 （cDNA／cRu）按一定的比例遞增，混和均勻約5min后，在200～650nm的范圍內(nèi)監(jiān)測配合物吸收光譜的變化.

1.4 配合物與DNA作用的熒光光譜

池中放入3.00mL釕（Ⅱ）配合物溶液 （10μmol·L－1），用移液器每次向樣品池加入等體積的DNA溶液，使DNA與配合物濃度比值 （cDNA／cRu）按一定的比例遞增，直至飽和.每次混和均勻約5min后，在500～750nm范圍監(jiān)測配合物的熒光光譜變化，用427nm光源激發(fā)，記錄發(fā)射光波峰和發(fā)光強(qiáng)度.

1.5 配合物對DNA熱變性的影響實(shí)驗(yàn)

DNA熱變性實(shí)驗(yàn)用安裝了Peltier PTP－6（±0.1℃）溫控儀的Lambda－850紫外光譜儀來完成.配制含有10μmol·L－1配合物的100μmol·L－1的DNA溶液以及不含配合物的100μmol·L－1的DNA溶液，放入冰箱過夜，測試前先在測量的起始溫度下恒溫30min.用緩沖溶液掃基線，并用其相應(yīng)濃度的配合物溶液作參比，測定在260nm處，DNA在配合物存在和不存在時，不同溫度下的吸光度，溫度范圍為40～94℃，升溫梯度為2℃，升溫速度為1℃／min.

1.6 配合物與DNA作用的CD光譜

透析實(shí)驗(yàn)需要在常溫避光條件下進(jìn)行.取10mL配合物 （50μmol·L－1）溶液于小燒杯中，再取5mL CT－DNA（1.0μmol·L－1）溶液置于透析袋，然后把透析袋放在透析液中攪拌12h，取透析液進(jìn)行CD光譜測定.

1.7 DNA黏度測試實(shí)驗(yàn)

黏度的測定采用烏氏黏度計(jì)，溫度恒定在30±0.1℃.DNA的濃度固定不變，逐漸增加Ru（Ⅱ）配合物濃度配制溶液.相對黏度按下式計(jì)算：η＝ （t－t0）／t0.式中，t0為緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間，t為DNA溶液（含不同濃度的配合物）流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間.以（η／η0）1／3對比r（r＝ ［Ru］／［DNA］）作圖.η0為未加配合物時DNA溶液的相對黏度.

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物與DNA相互作用的電子吸收光譜

配合物與DNA的作用會改變配體所處的環(huán)境，光譜的變化則可反映結(jié)合的強(qiáng)弱.配合物與DNA作用的滴定吸收光譜如圖2所示.與DNA作用后，配合物的MLCT峰紅移了3nm，減色率為12.03%；位于紫外區(qū)292和262nm處的配體內(nèi)部的LC躍遷和π－π＊躍遷峰的減色則要明顯一些，分別為16.30%和44.38%.

為了定量比較配合物與DNA作用的強(qiáng)弱，通過紫外滴定光譜實(shí)驗(yàn)，以配合物在453nm處的吸光度變化，按下列方程計(jì)算出配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)Kb.

圖2 配合物與DNA作用后的紫外可見光譜圖Fig.2 Absorption spectra of the complex interacted with CT－DNA

式中，［DNA］為 CT－DNA 的濃度，εf，εa和εb分別是配合物游離、與各濃度DNA結(jié)合時以及與DNA結(jié)合飽和時的摩爾吸光系數(shù)；ct為配合物總濃度，s為鍵合位點(diǎn)的大小，Kb為曲線擬合的結(jié)合常數(shù).配合物與DNA結(jié)合的常數(shù)為（5.79±0.54）× 105L·μmol－1（s＝ 0.33±0.01），與之前所做的工作中兩個配合物相比［7］，體現(xiàn)出較強(qiáng)的作用力，由于配體季銨鹽離子都帶有電荷，三甲胺配體較小的空間位阻就成為增加DNA與配合物之間作用力的重要因素.

圖3 配合物與DNA作用的熒光強(qiáng)度變化圖Fig.3 Emission spectra of the complex in buffer with increasing amounts of CT－DNA

2.2 配合物與DNA相互作用的熒光光譜

加入DNA后，若使釕（Ⅱ）配合物發(fā)出的熒光強(qiáng)度增加，則說明配合物與DNA發(fā)生某種方式的結(jié)合，熒光增強(qiáng)幅度的大小，一般能夠反映配合物與DNA作用的強(qiáng)弱，但并不反映具體的結(jié)合模式.熒光的增強(qiáng)在于DNA保護(hù)了配合物，使它不受水分子的進(jìn)攻.配合物的熒光滴定曲線見圖3，在加入DNA后，配合物的熒光增強(qiáng)幅度為原來的2.81倍，說明配合物受到DNA很好的保護(hù).而與文獻(xiàn)［7］中兩個配合物相比，熒光的增強(qiáng)規(guī)律與紫外并不完全相同，類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在我們另外的工作中［11］.我們推測，配合物較大的水溶性使部分熒光被淬滅，因而增強(qiáng)的程度并不大.

2.3 配合物對DNA熱變性的影響

DNA的熱變性經(jīng)常被用來研究核酸與小分子配合物相互作用的穩(wěn)定性大小，同時提供溫度上升時DNA構(gòu)象的變化和鍵合強(qiáng)度等信息.DNA在溫度上升過程中，氫鍵遭到破壞，雙鏈逐步解離成單鏈，一半DNA堿基解旋時對應(yīng)的溫度為DNA的熔點(diǎn)（tm）.變性時螺旋解開會造成原本藏于內(nèi)側(cè)的堿基外露，260 nm處的紫外吸收增加.當(dāng)小分子與DNA以插入模式相結(jié)合時，由于能夠和DNA堿基對之間發(fā)生π－π堆積作用，穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而使DNA的熔點(diǎn)（tm）有明顯升高［12］，而配合物與DNA之間僅僅通過簡單的溝面結(jié)合、靜電或氫鍵等弱結(jié)合時，Δtm變化則相對要小很多［9］.

圖4給出了DNA在未加配合物前和加入配合物后的熱變曲線，從圖中可以得到DNA在緩沖溶液中的熔點(diǎn)為60.8℃，使 ［Ru］／［DNA］＝1∶10后，熔點(diǎn)升至84.2℃，升高幅度為23℃.熔點(diǎn)如此明顯的升高表明配體phen極有可能與DNA的堿基發(fā)生了較強(qiáng)的π－π堆積作用，從而提高了CT－DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.

2.4 配合物與DNA作用的CD光譜

CD光譜可以對配合物在溶液中的手性物種提供有效的光譜信息.如果配合物的兩種手性對應(yīng)體與DNA的結(jié)合力相同，透析一段時間后，透析液中兩種對應(yīng)體的濃度相等，便沒有CD信號出現(xiàn)；如果配合物的兩種對映體與DNA的作用力不同，那么透析完成后，與DNA結(jié)合力較強(qiáng)的對映體在透析液中的濃度應(yīng)較低，透析液具有旋光性，可以用CD光譜檢測產(chǎn)生的誘導(dǎo)光譜ICD［13－14］.據(jù)文獻(xiàn)報道［15－16］，配合物中右手螺旋的異構(gòu)體由于合適的空間匹配性比左手螺旋的異構(gòu)體更容易和具有右手螺旋結(jié)構(gòu)的CT－DNA結(jié)合，所以配合物與DNA的立體選擇性很容易通過CD信號得到.

配合物溶液與DNA經(jīng)過透析實(shí)驗(yàn)后，透析液在紫外區(qū)的CD光譜如圖5所示.從圖中可以看出，配合物在230～350nm出現(xiàn)CD信號，255nm處出現(xiàn)一個正峰，268和297nm處出現(xiàn)兩個負(fù)峰，這是典型的由立體選擇性的手性異構(gòu)體與DNA作用后所產(chǎn)生的ICD峰［17］.這表明，配合物對DNA具有很好的立體選擇性，并且右旋異構(gòu)體優(yōu)先與DNA結(jié)合.

圖4 DNA在無配合物和有配合物存在下的熱變性曲線圖Fig.4 Normalized UV melting curves of CT－DNA in the absence or presence of the complex

圖5 配合物對CT－DNA透析液的CD光譜圖Fig.5 CD spectra of the complex in the presence of CT－DNA

2.5 配合物與DNA的黏度測定

黏度測試作為檢測配合物與DNA結(jié)合模式的最有效的方法之一，比光譜數(shù)據(jù)更有說服力［18－19］.當(dāng)小分子配合物以經(jīng)典插入方式與DNA作用時，DNA相鄰堿基對的距離會變大來容納插入配體，從而導(dǎo)致DNA雙螺旋伸長，DNA溶液的黏度增加；而當(dāng)配合物與DNA以部分插入方式作用時，就會使DNA的雙螺旋鏈發(fā)生褶皺、彎曲、扭結(jié)，導(dǎo)致其相對黏度下降；此外，一些小分子如［Ru（bpy）3］2＋，主要以靜電作用結(jié)合，DNA溶液的黏度則沒有明顯變化.

在配合物，對照物EB及［Ru（bpy）3］2＋存在下，DNA的相對黏度變化如圖6所示.EB作為經(jīng)典插入試劑，能使DNA雙螺旋鏈的長度增加，從而使其相對黏度增加.而［Ru（bpy）3］2＋，主要以靜電模式與DNA鍵合，則對DNA的黏度幾乎沒有影響.從圖6可以看出，隨著配合物濃度的逐漸增大，黏度先增加，后減小，然后又逐漸增加，這種結(jié)合模式明顯不同于［Ru（bpy）3］2＋的靜電結(jié)合，也不完全與半插入模式相同.由于配合物的特殊結(jié)構(gòu)，季銨離子正電荷的存在，增大了它與DNA之間的靜電引力，同時，熱變性實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)出較強(qiáng)的π－π堆積效應(yīng)，我們推測兩種模式都有，這兩種作用之間的協(xié)同效應(yīng)，增加了它們之間的作用力.

結(jié)論：利用紫外－可見吸收光譜滴定得到了配合物與CT－DNA作用的結(jié)合常數(shù)為5.79×105；熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)顯示加入DNA后，配合物在緩沖溶液中的熒光強(qiáng)度增幅為2.81倍；熱變性實(shí)驗(yàn)表明，在配合物的存在下DNA的熔點(diǎn)升高可達(dá)到20多度，說明配合物的配體與DNA之間存在較強(qiáng)的π－π堆積效應(yīng)；并且這種作用可能是半插入和靜電作用協(xié)同的結(jié)果.綜上所述，配合物結(jié)構(gòu)改變后，由于位阻的減小和配體電荷的存在，可以增加它與DNA之間的作用強(qiáng)度.

圖6 配合物、EB和 ［Ru（bpy）3］2＋ 與CT－DNA作用后對黏度的影響Fig.6 Effects of increasing amounts of Ru，EB and Ru（bpy）2＋3on the relative viscosities of CT－DNA at 30±0.1℃，［DNA］＝0.5μmol·L－1，r＝ ［Ru］／［DNA］

［1］TAN Cai Ping，LAI Sen Sen，WU Shou Hai，et al.Nuclear permeable ruthenium（Ⅱ）β－carboline complexes induce autophagy to antagonize mitochondrial－mediated apoptosis［J］.J Med Chem，2010，53：7613－7624.

［2］TAN Li Feng，LIU Jing，SHEN Jian Liang，et al.First ruthenium（Ⅱ）polypyridyl complex as a true molecular“l(fā)ight switch”for triplex RNA structure：［Ru（phen）2（mdpz）］2＋enhances the stability of poly（U）poly（A）＊poly（U）［J］.Inorg Chem，2012，51：4417－4419.

［3］ELMES R B P，KITCHEN J A，WILLIAMS D C，et al.Pushing the limit：synthesis，photophysical and DNA binding studies of a NIR－emitting Ru（Ⅱ）－polypyridyl probe with light switch′behaviour［J］.Dalton Trans，2012：6607－6610.

［4］袁益嫻，陳 禹，王貽燦，等.手性雙核釕（Ⅱ）配合物與DNA的相互作用研究［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報，2008，24（8）：1265－1271.

［5］HAMMON M J.Supramolecular DNA recognition［J］.Chem Soc Rev，2007，36：280－295.

［6］JI Liang Nian，ZOU Xiao Hua，LIU Jin Gang.Shape－and enantioselective interaction of Ru（Ⅱ）／Co（III）polypyridyl complexes with DNA［J］.Coord Chem Rev，2001，216－217：513－536.

［7］SUN Jing，WU Shuo，AN Yan，et al.Synthesis，characterization，and DNA－binding and DNA－photocleavage studies of two Ru（Ⅱ）complexes containing two main ligands and one ancillary ligand［J］.Polyhedron，2008，27：2845－2850.

［8］AN Yan，TONG Ming Liang，JI Liang Nian，et al.Double－strand DNA cleavage by copper complexes of 2，2′－dipyridyl with electropositive pendants［J］.Dalton Trans，2006：2066－2071.

［9］LI Ji Hui，WANG Jin Tao，HU Ping，et al.Synthesis，structure and nuclease activity of copper complexes of disubstituted 2，2′－bipyridine ligands bearing ammonium groups［J］.Polyhedron，2008，27：1898－1904.

［10］SULLIVAN B P，SALMON D J，MEYER T J.Mixed phosphine 2，2′－bipyridine complexes of ruthenium［J］.Inorg Chem，1978，17：3334－3341.

［11］SUN Jing，AN Yan，ZHANG Li，et al.Studies on synthesis，characterization，and G－quadruplex binding of Ru（Ⅱ）complexes containing two dppz ligands［J］.J Inorg Biochem，2011，105：149－154.

［12］NEYHARTG A，GROVER N，SMITH S R，et al.Binding and kinetics studies of oxidation of DNA by oxoruthenium（IV）［J］.J Am Chem Soc，1993，115：4423－4428.

［13］DELANEY S，PASCALY M，BHATTARCHATYA P，et al.Oxidative damage by ruthenium complexes containing the dipyridophenazine ligand or its derivatives：a focus on intercalation［J］.Inorg Chem，2002，41：1966－1974.

［14］HIORT C，NORDEN B，RODGER A.Enantiopreferential DNA binding of［RuⅡ（1，10－phenanthrline）3］2＋studied with linear and circular dichroism［J］.J Am Chem Soc，1990，112：1971－1982.

［15］BARTON J K，RAPHAEL A L.Photoactivated stereospecific cleavage of double－h(huán)elical DNA by cobalt（III）complexes［J］.J Am Chem Soc，1984，106：2466－2468.

［16］KUMAR C V，BARTON J K，TURRO N J.Photophysics of ruthenium complexes bound to double helical DNA［J］.J Am Chem Soc，1985，107：5518－5523.

［17］MAHESWARI P U，RAJENDIRAN V，PALANIANDAVAR M，et al.Synthesis，characterization and DNA－binding properties of rac－［Ru（5，6－dmp）2（dppz）］2＋－enantiopreferential DNA binding and co－ligand promoted exciton coupling［J］.J Inorg Biochem，2006，100：3－17.

［18］SATYANARAYANA S，DABROWIAK J C，CHAIRES J B.NeitherΔ－norΛ－tris（phenanthroline）ruthenium（Ⅱ）binds to DNA by classical intercalation［J］.Biochemistry，1992，31：9319－9324.

［19］ZOU Xiao Hua，YE Bao Hui，LI Hong，et al.The design of new molecular“l(fā)inght switches”for DNA［J］.J Biol Inorg Chem，2001，6：143－150.