雞胚中禽波氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

楊萍萍，譚燕玲，趙 雪，劉靜靜，賀曉華，劉冠華，朱瑞良

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安，271018)

禽波氏桿菌(Bordetella avium，B．a(chǎn)vium)曾被稱為Ⅰ型糞產(chǎn)堿桿菌，與百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌同屬于產(chǎn)堿桿菌科的波氏桿菌屬。最早于1967年分離自火雞［1］，并于1984年被正式命名為禽波氏桿菌［2］。在中國，1991年朱瑞良最先從患病雞中發(fā)現(xiàn)并分離到該菌［3］。該菌在國外主要作為火雞的呼吸道性病原存在［4，5］，而在我國養(yǎng)殖環(huán)境中多病原共存尤其是免疫抑制性病毒廣泛存在［6，7］，使得禽波氏桿菌病的流行愈來愈嚴(yán)重且出現(xiàn)新的動向［8］。

自2009年5月以來，山東某大型海藍(lán)褐種禽孵化場種禽出現(xiàn)除產(chǎn)蛋率下降外無其他明顯外觀癥狀，但所產(chǎn)種蛋在孵化過程中出現(xiàn)明顯的胚胎死亡(18．7%)、孵化率降低(80．3%)以及孵出弱雛率增多(16．5%)等現(xiàn)象。取其18日齡將出殼胚胎作為備檢材料進(jìn)行病原的分離鑒定，確定為禽波氏桿菌感染所致，并對所分離的禽波氏桿菌菌株進(jìn)行了23S rRNA序列擴增和耐藥性分析。

1 材料與方法

1．1 病料

山東某大型海藍(lán)褐種禽孵化場18日齡雞胚350枚，其中活胚、死胚數(shù)量各占50%，作為被檢材料。

1．2 菌株

試驗中所用9株禽波氏桿菌菌株來源見表1，為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室多年來分離鑒定并保存。

1．3 試劑及培養(yǎng)基

生化鑒定管(上海伊華);B．a(chǎn)vium平板凝集抗原和陽性血清(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供);細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(Tiangen);PCR反應(yīng)所用試劑、pMD18-T載體(TaKaRa);腦心肉湯、綿羊血體積分?jǐn)?shù)為0．05的綿羊血鮑姜氏(B-G)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂(Difco)均按說明書配制，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 雞胚中細(xì)菌的分離培養(yǎng)及病毒的PCR擴增

將送檢的雞胚編號并蛋殼消毒后，用接種環(huán)分別從雞胚的眼睛、體表以及肝臟等處分離細(xì)菌，劃線接種于綿羊血體積分?jǐn)?shù)為0．05的綿羊血鮑姜氏(B-G)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板，于37℃培養(yǎng)24～48 h，檢查生長情況及菌落特征，并挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行傳代純化培養(yǎng)，以備鑒定。細(xì)菌分離培養(yǎng)完成后，提取雞胚DNA，按文獻(xiàn)［9］中所建立的REV，CIAV，ALV-J和MDV四重PCR和IBDV，VAV RT-PCR方法進(jìn)行病毒的基因擴增，以分析是否存在病毒感染。

1．5 細(xì)菌的抹片、染色、鏡檢

挑取所分離到的細(xì)菌純培養(yǎng)菌落涂片，火焰固定后按常規(guī)革蘭氏染色法染色，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1．6 分離菌的生化鑒定

將分離菌株的純培養(yǎng)物分別接種于各種生化鑒定管，進(jìn)行甲基紅實驗，V-P實驗，糖(醇及苷)類代謝，枸櫞酸鹽(利用)，硝酸鹽(還原)，硝酸鹽(產(chǎn)氣)，H2S，過氧化物酶，尿素酶，乙酰胺等生化特性的檢測，37℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1．7 分離菌的血清學(xué)鑒定

對所分離細(xì)菌制備凝集抗原［10］，與禽波氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌和葡萄球菌的陽性血清分別進(jìn)行平板凝集反應(yīng)。

1．8 分離菌23S rRNA的PCR擴增及序列分析

根據(jù)GenBank已發(fā)表的B．a(chǎn)vium(NC-010645)的23S rRNA序列，用DNAStar軟件設(shè)計1對引物，目的基因大小為710 bp，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物:5’-GGAACTTACCCGACAAGGAAT-3’(946-966)

下游引物:5’-TGGAGGTATCAGAAGTGCGAAT-3’(1 634-1 655)

細(xì)菌基因組DNA提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系(25 μL)，反應(yīng)條件為94℃ 10 min后，再運行35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃ 1 min，55℃ 1 min和72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min，質(zhì)量濃度為8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應(yīng)產(chǎn)物的純化根據(jù)膠回收試劑盒的操作說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體的連接以及感受態(tài)細(xì)胞(E．coli TGI)的制備及轉(zhuǎn)化，均按文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行。經(jīng)序列測定后同實驗室所保存9株(來源見表1)B．a(chǎn)vium菌株及GenBank中B．a(chǎn)vium NC-010645株進(jìn)行序列同源性比較。

1．9 耐藥性分析

采用47種藥物對所分離到的細(xì)菌菌株按紙片擴散法進(jìn)行藥敏實驗，參照藥敏片廠家說明書進(jìn)行操作，并根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的藥敏實驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定［11］，從而對分離菌的耐藥狀況做出評價。所選用的47種藥敏片的藥物為阿米卡星、氧氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、利福平、氯霉素、氧呱噙青霉素、卡那霉素、頭孢拉定、萬古霉素、頭孢羥氨芐、復(fù)達(dá)欣、呋喃妥因、甲氧西林、復(fù)方新諾明、頭孢克肟、阿莫西林、先鋒V、紅霉素、菌必治、妥布霉素、慶大霉素、氟哌酸、頭孢呋肟、青霉素、克林霉素、麥迪霉素、米諾環(huán)素、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢呋辛、克拉霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、大觀霉素、多粘菌素B、左氟沙星、頭孢噻啶、氨曲南、苯唑西林、諾氟沙星、頭孢西丁、哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢氨芐。

表1 禽波氏桿菌菌株來源

2 結(jié)果與分析

2．1 雞胚中細(xì)菌的分離培養(yǎng)及病毒的PCR擴增結(jié)果

從大部分死胚(172/175)和少部分活胚(31/175)的眼睛、體表和肝臟均可分離到細(xì)菌，從菌落形態(tài)判斷為同一種細(xì)菌，且數(shù)量上以體表最多，其次是眼睛，肝臟中最少。該種細(xì)菌在綿羊血體積分?jǐn)?shù)為0．05的綿羊血鮑姜氏(B-G)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落光滑、凸起、濕潤、半透明白色珍珠狀;而在普通營養(yǎng)瓊脂平板上于24 h后可見比針尖稍大菌落，形態(tài)同血瓊脂培養(yǎng)基上類似;在麥康凱瓊脂平板上24 h表現(xiàn)為針尖稍大的微暗紅色菌落，隨時間延長，菌落顏色減淡。經(jīng)多重PCR和RT-PCR擴增，未擴增到病毒的基因片段。

2．2 分離菌的鑒定

涂片后染色鏡檢發(fā)現(xiàn)所分離菌革蘭氏染色陰性，短小桿狀。生化鑒定結(jié)果見表2，該分離菌不能利用任何糖、醇以及苷類碳水化合物;能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源生長，但不能利用酒石酸鹽;硝酸鹽(還原)為陰性，硝酸鹽(產(chǎn)氣)為陽性;能利用乙酰胺;在對酶類的試驗中氧化酶、過氧化氫酶、精氨酸脫羧酶為陽性，精氨酸雙水解酶為陰性;不能在質(zhì)量濃度為65 g/L的NaCl培養(yǎng)基中生長。在血清學(xué)鑒定中能與B．a(chǎn)vium陽性血清發(fā)生特異性凝集。根據(jù)所分離菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)性狀、染色特性、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等結(jié)果，初步鑒定所分離菌為B．a(chǎn)vium，命名為LL09株。

表2 分離菌的生化鑒定結(jié)果

2．3 分離菌的23S rRNA的PCR擴增及序列分析

新分離B．a(chǎn)vium同實驗室所保存的另外9株禽波氏桿菌的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后均得到710 bp大小的目的條帶，與預(yù)期的片段大小相符。經(jīng)序列測定(Genebank No．HM545299)和系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，新分離LL09株的核苷酸序列與XT09株的同源性為100%，與其它8株B．a(chǎn)vium的同源性為96．2% ～96．6%，與GenBank中收錄的B．a(chǎn)vium NC-010645的同源性為95．8%。

圖1 分離菌LL09與B．a(chǎn)vium菌株的23S rRNA進(jìn)化樹分析比較

2．4 耐藥性分析

分離菌的藥敏實驗結(jié)果表明，該菌對所檢測的14類47種藥物中有28種呈現(xiàn)完全耐藥，6種為低敏，只有13種藥物比較敏感(表3)。耐受藥物中包括了頭孢類、青霉素類、單酰胺環(huán)類、大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類、磺胺類等常用藥物。只有喹諾酮類、氨基糖苷類和呋喃類中的部分藥物的殺菌效果較好。

表3 分離菌的耐藥性分析

3 討論

B．a(chǎn)vium能夠在禽類的上呼吸道定植，并導(dǎo)致火雞咳嗽以及禽類的鼻炎、眼炎等癥狀［12，13］，已經(jīng)眾所周知。近年來在對一些大型種禽孵化場進(jìn)行胚胎性疫病病原分析時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)其在胚胎中的感染，導(dǎo)致孵化率降低、弱雛率增高等狀況［9］。

試驗中從山東某種禽孵化場送檢的將出殼雞胚中分離到1株B．a(chǎn)vium，經(jīng)染色鏡檢、生化實驗及血清學(xué)鑒定，完全符合B．a(chǎn)vium的特征，命名為LL09株。在進(jìn)行23S rRNA序列分析時發(fā)現(xiàn)，LL09株與同年從另一地區(qū)孵化場死胚中所分離的XT09株呈現(xiàn)100%同源性，而同以往實驗室分別從患眼炎雞的眼睛和患鼻炎雞的鼻腔所分離的經(jīng)典菌株以及Genebank中菌株NC-010645相距相對較遠(yuǎn)，表明該分離株與以往菌株以及國外菌株NC-010645在基因上存在一定差異。這與文獻(xiàn)報道［14］國內(nèi)分離的禽波氏桿菌菌株與國外分離菌株在遺傳基因上存在差異基本一致。

為保證耐藥性分析的準(zhǔn)確性，本次研究采用了14類47種藥物對分離菌進(jìn)行藥敏實驗，涉及青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、糖肽類、磺胺類、四環(huán)素類、氯霉素類、呋喃類、喹諾酮類、多肽類等各個種類。耐藥性分析結(jié)果表明，所分離到的菌株存在廣泛的耐藥性，常用的幾類藥物大多耐藥嚴(yán)重。與以往實驗室分離菌株相比［15］，該菌的耐藥譜更為廣泛，隨著年份的增長，B．a(chǎn)vium的耐藥性呈上升趨勢。另一方面也表明，種雞場耐藥性菌株的廣泛存在，孵化場急需對藥物的應(yīng)用進(jìn)行劑量和種類的規(guī)范化管理。

綜上分析，該B．a(chǎn)vium分離株在雞胚中的感染一方面可能與該菌株與傳統(tǒng)呼吸道分離株的基因存在差異有關(guān);另一方面與種雞場多年的用藥習(xí)慣有關(guān)，藥物的濫用使菌株產(chǎn)生適應(yīng)性和耐藥性得以在雞體長期潛伏存在，從而導(dǎo)致孵化場胚胎性疾病的發(fā)生。

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