大蒜莖尖離體再生體系的建立

宋淑敏，劉偉偉，王云云，高 宇，潘 靜，王曉楠

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163319)

大蒜(Allium sativum L.)在我國已有2 000多年的栽培歷史。目前我國大蒜種植面積達(dá)26.6萬hm2，占亞洲的1/2，占世界的1/3;同時(shí)中國是世界上大蒜的主要出口貿(mào)易國之一，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷東南亞、日本、中東、美國、俄羅斯等國家及地區(qū)，為我國換取了大量的外匯。大蒜具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是很好的滋補(bǔ)強(qiáng)身蔬菜。大蒜對(duì)多種致病微生物及寄生蟲有較強(qiáng)的抑制或殺滅作用，被醫(yī)務(wù)工作者稱為植物性廣譜抗生素，它對(duì)心臟病、高血壓和某些癌癥也有預(yù)防作用。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們?cè)絹碓街匾暣笏獾臓I養(yǎng)以及保健價(jià)值，大蒜的需求量逐年增加，大蒜及其加工產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、食品、醫(yī)藥、飼料及美容等行業(yè)。

黑龍江省是我國大蒜的主產(chǎn)區(qū)，其中阿城大蒜、寧安大蒜以其獨(dú)特的風(fēng)味和極佳的品質(zhì)享譽(yù)全國，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，并遠(yuǎn)銷到日本、韓國等地。1998年阿城被國家命名為“中國北方大蒜之鄉(xiāng)”，2008年“阿城大蒜”注冊(cè)為農(nóng)產(chǎn)品國家“地理標(biāo)志”商標(biāo)。但由于多年的連作致使品質(zhì)退化，具有800年種植歷史的阿城大蒜種植業(yè)正走向衰退、崩潰的邊緣。阿城紫皮大蒜退化的根本原因?yàn)槭怯捎谵r(nóng)民常年自留蒜種，在使用過程中嚴(yán)重感染病毒病，致使品種嚴(yán)重退化，產(chǎn)量和品質(zhì)降低。據(jù)測(cè)定，大蒜病毒病發(fā)病率達(dá)到90%以上，大蒜感染病毒病主要表現(xiàn)為蒜頭逐年變小、產(chǎn)量低、品質(zhì)差，一般減產(chǎn)達(dá)到30% ～50%;不僅直接造成農(nóng)業(yè)損失，也使我省的名、優(yōu)、特品種失去了市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，甚至使一些珍稀品種瀕臨滅絕，嚴(yán)重制約了我省大蒜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)培育、繁育脫毒蒜用于生產(chǎn)是防治病毒病的有效途徑。國內(nèi)外關(guān)于大蒜脫毒苗的培育已有大量的研究，應(yīng)用莖尖分生組織培養(yǎng)獲得脫毒苗是當(dāng)前普遍采用的方法，許多品種都已獲得了脫毒苗。但應(yīng)用莖尖組培脫毒，因取材較小，莖尖成活率和分化率不高，繁殖系數(shù)低，嚴(yán)重地制約了大蒜脫毒種苗的繁育及應(yīng)用進(jìn)程。目前黑龍江省大蒜生產(chǎn)上急需優(yōu)質(zhì)脫毒種蒜，但我省還沒有專門從事大蒜脫毒及原種繁育為一體的科研單位。

本研究的目的是以黑龍江省名優(yōu)大蒜莖尖為材料，采用不同濃度激素、蔗糖進(jìn)行配比，篩選高效的分化、繼代、生根培養(yǎng)基;對(duì)莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)條件進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期探索一套適于黑龍江省名優(yōu)大蒜莖尖脫毒技術(shù)體系，為大蒜脫毒種苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用新收獲的阿城大蒜，將鱗莖放入4℃～6℃的冰箱中貯藏30～40 d，以打破休眠備用。

1.2 材料預(yù)處理及外殖體表面消毒

挑選無病斑的鱗莖，將鱗芽剝?nèi)ケ砥?，用紗布包裹好，先用自來水沖洗0.5 h，然后在超凈臺(tái)上，用75%的酒精表面消毒2 min，再用20%的次氯酸鈉表面消毒20 min，然后用無菌水洗3次。

1.3 莖尖剝離方法及培養(yǎng)條件

在超凈工作臺(tái)上，用解剖刀剝?nèi)〗?jīng)表面消毒鱗芽里面的葉芽，放在40倍解剖鏡下，再用解剖刀剝?nèi)?.2～0.5 mm的莖尖，接種到培養(yǎng)基上。然后放在室溫為25℃，光照強(qiáng)度為2 000 LX，光照時(shí)間為12 h/d的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.4 基本培養(yǎng)基的篩選

以阿城大蒜莖尖為材料，分別接種到附加6—BA1.0 mg/L、NAA0.1 mg/L 的 MS、B5、N6培養(yǎng)基中，接種15d 后統(tǒng)計(jì)莖尖的成活率和綠苗繁殖倍數(shù)。

1.5 不同濃度激素配比對(duì)莖尖分化率的影響

以MS為基本培養(yǎng)基上，附加不同濃度的6—BA、NAA、IAA的激素組合，共設(shè)了8個(gè)處理，每個(gè)處理接種莖尖90個(gè)，15 d后統(tǒng)計(jì)莖尖分化率和綠苗繁殖倍數(shù)。

1.6 繼代培養(yǎng)基篩選

當(dāng)從莖尖分化出的綠苗高2 cm左右時(shí)，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)入到繼代培養(yǎng)基中。繼代培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，對(duì)6—BA 0 ～0.5 mg/L、NAA 0 ～1.0 mg/L、IAA 0 ～1.0 mg/L 不同濃度激素進(jìn)行配比試驗(yàn)，pH為5.8～6.0，共設(shè)13個(gè)處理，15 d后觀察統(tǒng)計(jì)苗的長(zhǎng)勢(shì)及生根情況。

1.7 生根培養(yǎng)基篩選

以1/2MS培養(yǎng)基成分為基礎(chǔ)，pH值為5.8～6.0，調(diào)整植物激素 IAA(0.1 ～0.5)mg/L、NAA(0.1 ～0.5)mg/L、蔗糖(10 000～60 000)mg/L濃度，共設(shè)G1～G15組進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化率和綠苗的增殖倍數(shù)的影響

我們選用B5、MS、N6三種培養(yǎng)基作為莖尖分化培養(yǎng)基，三種培養(yǎng)基均附 1.0 mg/L6—BA、0.1 mg/LNAA，pH 為5.8～6.0。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 B5、MS、N6培養(yǎng)基對(duì)大蒜莖尖分化的影響Tab.1 The effect of B5、MS、N6medium on the differentiation of garlic shoot-tip of

從表1的試驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，不同培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化率影響差異顯著，以MS培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好，莖尖的分化率、綠苗的增殖倍數(shù)最高;B5培養(yǎng)基培養(yǎng)效果要好于N6培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜莖尖分化培養(yǎng)基的優(yōu)劣順序?yàn)镸S＞B5＞N6。

2.2 不同激素配比對(duì)莖尖分化率及綠苗繁殖倍數(shù)的影響

我們以MS培養(yǎng)基為莖尖分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并附加了不同濃度的 6—BA、NAA、IAA，pH 為 5.8 ～ 6.0，共設(shè)了8個(gè)處理。莖尖接種到分化培養(yǎng)基中，20 d后統(tǒng)計(jì)莖尖分化率及綠苗增殖倍數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 不同濃度激素配比對(duì)莖尖分化率及綠苗增殖倍數(shù)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of hormones on rate of shoot-tip differentiation and multiplication of green plantlet

從表2可以看出，8個(gè)處理均有綠芽的分化，但以1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA 激素組合效果為最好，莖尖的分化率達(dá)93.3%，繁殖倍數(shù)為5.2;當(dāng)6—BA濃度超過1.5 mg/L，隨著6—BA濃度的增加，莖尖的分化率降低，分化出玻璃苗的數(shù)量增加。因此，最佳的莖尖分化培養(yǎng)基為F3:MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA。

2.3 不同繼代培養(yǎng)基對(duì)苗的長(zhǎng)勢(shì)影響

表3的試驗(yàn)結(jié)果表明:在13種繼代培養(yǎng)基中，D3、D7、D8培養(yǎng)基繼代效果較好，其中以D7培養(yǎng)基的繼代效果最好，在D7培養(yǎng)基中幼苗生長(zhǎng)健壯，苗的成活率最高，達(dá)100%。其次是D3，該培養(yǎng)基中苗的成活率較高，并有一定數(shù)量的幼苗生根，但苗的成活率低于D7。因此，最適的繼代培養(yǎng)為:1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。從表 3中我們還可以看出當(dāng)繼代培養(yǎng)基附加6—BA 0.1 mg/L時(shí)，NAA濃度0.2～1.0 mg/L，隨著NAA增加綠苗的成活率和生根率也隨之增加。

表3 不同繼代培養(yǎng)基對(duì)綠苗長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.3 Effects of different subculture medium on growth of green plantlet

2.4 生根及移栽

選取3～5 cm高的試管苗，在超凈臺(tái)上將苗基部的愈傷組織去除，分別轉(zhuǎn)入到15種生根培養(yǎng)基中，pH為5.8～6.0，在25℃ ～28℃，光照強(qiáng)度為2 000 LX，光照時(shí)間為12 h/d條件下培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根長(zhǎng)、試管鱗莖的誘導(dǎo)率。當(dāng)根長(zhǎng)達(dá)2～3 cm時(shí)，打開瓶膜，加入一定量的蒸餾水，讓試管苗充分吸收水分，煉苗1～3 d，然后將根部的培養(yǎng)基洗凈，進(jìn)行移栽，移栽后要澆透水，注意避光、保濕，15 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明:不同濃度生長(zhǎng)素、蔗糖對(duì)根的誘導(dǎo)率和生根數(shù)有較大影響，其中以 1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖組合的效果最佳。在該組合培養(yǎng)基中，大蒜試管苗植株健壯，不定根發(fā)生數(shù)量較多，并對(duì)試管鱗莖的形成有一定的促進(jìn)作用，有利于試管苗移栽成活。試管苗的生根率達(dá)95%，移栽成活率為98.6%，試管微鱗莖的誘導(dǎo)率為15%，均高于其他組。因此，最佳的生根培養(yǎng)基為:1/2MS 附加 0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖。

3 小結(jié)

A.本研究初步建立了適于黑龍江省大蒜莖尖離體再生技術(shù)體系。獲得試管苗7 000余株。為培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的黑龍江大蒜奠定了基礎(chǔ)，對(duì)解決黑龍江省名優(yōu)品種種性退化、促進(jìn)大蒜產(chǎn)業(yè)發(fā)展及提高農(nóng)民收入具有重要意義。

B.本試驗(yàn)篩選出最適莖尖分化培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA，莖尖的分化率達(dá) 93.3%，繁殖倍數(shù)為 5.2;最適繼代培養(yǎng)基 1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L 蔗糖。

表4 不同的激素配比對(duì)試管苗的生根率及移栽成活率的影響Tab.4 Effects of different hormone on rooting rate and transplanting survival rate of plantlets in vitro

C.大蒜莖尖離體培養(yǎng)受多種因素的影響，在分化培養(yǎng)中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在調(diào)控離體器官發(fā)生中起關(guān)鍵作用。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明:較高濃度的6—BA和低濃度的NAA有利于大蒜莖尖綠苗的分化。在繼代培養(yǎng)中，加入較高濃度的NAA和IAA，苗易生根;低濃度的生長(zhǎng)素配合低濃度的細(xì)胞分裂素有利于苗的復(fù)壯。此外，如何提高綠苗的增殖倍數(shù)及誘導(dǎo)大蒜試管微鱗莖形成還有待進(jìn)一步研究。