秦皇島地區(qū)夏冬季病毒感染與兒童急性上呼吸道感染臨床分析

顧艷紅 劉蘭吉 劉波 陳旭霞 蘇穎

急性上呼吸道感染是兒科最常見的疾病之一，引起急性呼吸道感染的病毒群至少有7個(gè)病毒科10多類共239個(gè)型別的病毒［1］。兒童上呼吸道感染的病毒病原學(xué)研究尚缺大樣本的系統(tǒng)研究。2009年，甲型H1N1流行性感冒在全世界爆發(fā)［2］。2010年8月，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布2009甲型H1N1流感進(jìn)入大流行后階段［3］。秦皇島地區(qū)位于燕山山脈東段丘陵地區(qū)與山前平原地帶，氣候類型屬于暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候。但受海洋影響較大，四季分明。我院為三級(jí)甲等醫(yī)院，患者來自覆蓋秦皇島地區(qū)的三區(qū)、四縣。為調(diào)查在該特定背景下我市兒童急性上呼吸道感染夏冬季節(jié)的病毒感染特征，我院采用多重PCR方法進(jìn)行系統(tǒng)的相關(guān)研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 依據(jù)上呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，選取來秦皇島市第一醫(yī)院門診就診的0～14歲急性上呼吸道感染患兒：2010年6月至2010年8月共191例，因標(biāo)本破碎、病史記錄不清等剔除22例，送檢標(biāo)本169份。其中男91例，女78例;年齡0～1歲26例，1～歲48例，3～歲48例，6～14歲47例。2010年11月至2011年1月共182例，因標(biāo)本破損、病史記錄不全剔除30例，送檢標(biāo)本152份。其中男85例，女67例;年齡：0～歲19例，1～歲49例，3～歲43例，6～14歲41人。入選病例病程均在72 h內(nèi)。

1.2 分組 按性別分男組，女組。按年齡分0～歲組、1～歲組、3～歲組、6～14歲組。按季節(jié)分夏季組、冬季組。按病程分：病程0～ h組，24～ h組，48～72 h組。以外周血超敏C-反應(yīng)蛋白(CRP)≤5 mg/L為正常值，＞5 mg/L為升高，分成2組。按有無基礎(chǔ)疾病分：既往健康組，存在先天性心臟病、營(yíng)養(yǎng)性貧血、免疫功能低下、反復(fù)呼吸道感染等基礎(chǔ)疾病組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 本實(shí)驗(yàn)共采用3組PCR引物用于檢測(cè)15種呼吸道病毒。第1組引物用于擴(kuò)增腺病毒A/B/C/D、冠狀病毒229E/NL63、1、2、3型副流感病毒;第二組引物用于擴(kuò)增冠狀病毒OC43/HKU1、鼻病毒A/B/C、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B;第3組引物用于擴(kuò)增博卡病毒1/2/3/4、乙型流感病毒、偏肺病毒、副流感病毒4型、腸道病毒。

1.3.1 標(biāo)本采集：入選患兒均在就診時(shí)進(jìn)行標(biāo)本采集：選用專業(yè)的絨毛拭子從患兒咽后壁涂抹咽部分泌物標(biāo)本，立即至于保存液中，置于-70℃低溫冰箱保存直至檢測(cè)，記錄患兒病史、癥狀及體征。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2.1 病毒核酸提?。翰捎庙n國(guó)的iNtRON Biotechnology公司生產(chǎn)的Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA Extraction Kit，按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取標(biāo)本中的病毒核酸。

1.3.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成CDNA：按美國(guó)Fermantas公司試劑盒說明書操作，8 μl Total RNA，1 μl randam hexamer(0.2 μg/μl)，3 μl DEPC-treated water，70℃，5 min，冰浴，加 2 μl 10 mmol/L dNTP，1 μl RNase inhibitor(20 U/μl)，混勻離心，37℃5 min，加入1 μl Reverse Transcriptase(200 U/μl)致終體積 20 μl，42℃60 min，70℃10 min，冰浴待用，-20℃保存。

1.3.2.3 多重PCR擴(kuò)增：使用Seegene公司生產(chǎn)的15種呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒(杭州紐羅西敏生物科技有限公司代理)。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 15 min，94℃變性 30 s，60℃退火1.5 min，72℃延伸 1.5 min，40 個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸 10 min，多重PCR產(chǎn)物置4℃保存至電泳檢測(cè)。

1.3.2.4 電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物：采用水平式瓊脂糖凝膠電泳儀，用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相及分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各呼吸道病毒的DNA檢測(cè)結(jié)果 成功擴(kuò)增出各呼吸道病毒的 DNA、CDNA結(jié)構(gòu)，分別為冠狀病毒229E/NL63，腺病毒，甲型流感病毒，鼻病毒，冠狀病毒OC 43/HKU 1，間質(zhì)肺病毒，腸道病毒，異型流感病毒;博卡病毒，通過1.0%的瓊脂糖凝膠，60 V低電壓電泳觀察結(jié)果(圖1～6)。具體病毒檢出情況。見表1。

2.2 總體病毒檢出率 共檢測(cè)標(biāo)本321份，陽(yáng)性208份，總檢出率64.80%。

2.3 病毒檢出率與性別的關(guān)系 男女之間病毒檢出率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.06，P ＞0.05)。見表2。

圖1 M：RV15-A Marker;6、9 和10號(hào)大小為189 bp，為副流感病毒3 229E/NL63;7號(hào)大小為534 bp，為腺病毒;1～5和8號(hào)分別為陰性結(jié)果

圖2 M：RV15-A Marker，1～9為陰性結(jié)果，大小為375 bp，為冠狀病毒;11號(hào)大小為264 bp，為副流感病毒2

圖3 M：RV15-BMarker;1～3，5號(hào)為陰性結(jié)果;4號(hào)大小為206 bp，為甲型流感病毒

圖4 M：RV15-BMarker;1～10為陰性結(jié)果;11號(hào)大小為394 bp為鼻病毒;12號(hào)大小為578 bp，為冠狀病毒OC 43/HKU 1

圖5 M：RV15-CMarker;1～7，9～11，為陰性結(jié)果;8號(hào)大小為351 bp，為間質(zhì)肺病毒;12號(hào)大小為455 bp，為異型流感病毒;13號(hào)大小579 bp，為博卡病毒

圖6 M：RV15-CMarker;1，2，4號(hào)為陰性結(jié)果;3號(hào)大小為194 bp，為腸道病毒

表1 病毒檢出情況 例

2.4 病毒檢出率與年齡的關(guān)系 夏季：1～歲組、3～歲組病毒檢出率明顯高于0～歲組及6～14歲組(P＜0.05)。冬季：0～歲組、1～歲組病毒檢出率明顯高于3～歲組，6～14歲組

表2 病毒檢出率與性別的關(guān)系 例

表3 病毒檢出率與年齡的關(guān)系(夏季)

表4 病毒檢出率與年齡的關(guān)系(冬季)

2.5 病毒檢出率與季節(jié)的關(guān)系 冬季病毒檢出率明顯高于夏季(χ2=13.175，P ＜0.01)。見表5。

表5 病毒檢出率與季節(jié)的關(guān)系

2.6 病毒檢出率與病程的關(guān)系 發(fā)病病程在24 h內(nèi)的檢出率高(P＜0.05)，24～48 h病毒檢出率及48～72 h檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表6。

表6 病毒檢出率與病程的關(guān)系

2.7 病毒檢出率與超敏CRP的關(guān)系 超敏CRP正常組的病毒檢出率明顯高于超敏CRP升高組病毒檢出率(χ2=31.355，P ＜0.01)。見表7。

表7 病毒檢出率與超敏CRP的關(guān)系

2.8 病毒檢出率與患兒基本健康狀況的關(guān)系 單純上呼吸道感染組的病毒檢出率與存在基礎(chǔ)疾病組的病毒檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.142，P ＞0.05)。見表8。

表8 病毒檢出率與患兒基本健康狀況的關(guān)系

3 討論

急性上呼吸道感染是人類最常見的疾病之一，兒童發(fā)病率極高。有研究表明，我國(guó)城市兒童每年平均患病3～6次，農(nóng)村兒童每年平均患病2～5次［4］。急性上呼吸道感染病原體以病毒為主。

3.1 檢測(cè)方法 本研究檢測(cè)急性上呼吸道感染的患兒咽部分泌物病毒檢出率為64.80%，與石偉先等［5］所做的病毒檢出率63.08%相近，低于 Chung等［6］及孔梅等［7］所做的兒童下呼吸道感染的病毒檢測(cè)率大于70%。但高于羅翌等［2］報(bào)道的包括成人在內(nèi)的上呼吸道感染的病毒檢出率49.2%?？紤]與感染的部位、采集的標(biāo)本不同有關(guān)：下呼吸道感染所采集的是深部的痰，而上呼吸道感染采集的是咽部分泌物，病毒含量相對(duì)較低，所以上呼吸道感染病毒檢出率低于下呼吸道感染;而羅翌等［2］所做的病毒檢測(cè)手段為病毒分離法，該方法特意性較強(qiáng)，但其消耗時(shí)間長(zhǎng)，需要成本高，分離陽(yáng)性率低，況且對(duì)某些病毒如人鼻病毒、人冠狀病毒、副流感病毒等進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)較困難［8］。而我們所采取的是多重PCR方法。此種方法最大的優(yōu)點(diǎn)是敏感、特異、快速，使某些不能培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的病毒能得以檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)多種病毒病原體。尤其是與相關(guān)技術(shù)合并后，其功能更為強(qiáng)大。其準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性大為增強(qiáng)。本研究中所采用的方法就是在多重PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上使用了DPOTM(DSOTM)技術(shù)應(yīng)用于引物設(shè)計(jì)，消除了既往多重PCR容易出現(xiàn)的非特異性條帶問題，同時(shí)引物的高效性與PCR產(chǎn)物的大小所帶來的矛盾，也得到很好的解決，同時(shí)提高了反應(yīng)的特異性。DPOTM(DSOTM)技術(shù)還消除了多重PCR引物之間的互相干擾，大大提高了多重PCR的敏感性。在短時(shí)間內(nèi)對(duì)15種病毒進(jìn)行檢測(cè)，大大提高了病毒檢出的準(zhǔn)確性，節(jié)省了時(shí)間。當(dāng)然，不同研究病毒檢出率的不同，也可能與不同病毒的流行特征及地區(qū)分布不同有關(guān)。

3.2 性別因素 本研究結(jié)果顯示，上呼吸道感染患兒病毒檢出率男女之間無差異性(P ＞0.05)，與相關(guān)報(bào)道［9］一致，提示呼吸道病毒感染無性別差異。

3.3 病毒檢出率與季節(jié)有關(guān) 冬季檢出率明顯高于夏季(P＜0.05)，支持病毒感染多見于冬春季［9］?？紤]其原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)冬季天氣寒冷，導(dǎo)致血液循環(huán)速度下降，從而導(dǎo)致人體免疫功能降低，白細(xì)胞吞噬功能減弱。(2)寒冷刺激導(dǎo)致副交感神經(jīng)興奮，氣道反應(yīng)性增高，從而支氣管易發(fā)生痙攣，有利于病原體的繁殖。(3)冬春季節(jié)空氣寒冷干燥使皮膚，尤其是口鼻黏膜變得更脆弱，氣道的纖毛運(yùn)動(dòng)減弱，黏液分泌減少，黏液黏稠度增加，導(dǎo)致呼吸道塵埃積聚及病原清除率下降［10］。

3.4 患病時(shí)間因素 本次研究發(fā)現(xiàn)，病程0～24 h的患兒病毒檢出率最高，考慮可能與病程早期病毒數(shù)量大、病毒毒性強(qiáng)、尚未用藥等因素有關(guān)。隨著病程的延長(zhǎng)，病毒檢出率下降，支持大部分病毒感染為自限性疾病。也可能與應(yīng)用藥物有關(guān)。

3.5 CRP水平因素 CRP是由肝臟合成，當(dāng)機(jī)體受到組織損傷或炎性反應(yīng)時(shí)迅速增加，故稱急性時(shí)相反應(yīng)蛋白［11］。研究已正實(shí)，CRP在健康人血清中以微量形式存在，而在炎癥和組織損傷時(shí)，由巨噬細(xì)胞釋放白介素，并迅速刺激肝臟合成。其不但能敏感的反應(yīng)機(jī)體的炎性反應(yīng)，并有激活補(bǔ)體及促進(jìn)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，具有與補(bǔ)體相似的調(diào)整和凝集作用，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬，刺激單核細(xì)胞表面的組織因子，表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)功能。當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，CRP血中濃度會(huì)急劇升高［12］。既往對(duì)于超敏CRP的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，外周血超敏CRP正常組病毒檢出率明顯高于超敏CRP升高組的患兒(P＜0.05)，提示超敏CRP在診斷病毒感染中有重要的參考價(jià)值，且此項(xiàng)檢查方便，短時(shí)間就能出結(jié)果，為臨床疾病的早期診斷及合理應(yīng)用抗生素提供了理論依據(jù)。

3.6 基礎(chǔ)疾病因素 在本次研究中，既往身體健康，單純上呼吸道感染組的病毒檢出率與存在基礎(chǔ)疾病組的病毒檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。存在基礎(chǔ)疾病，提示患兒免疫功能欠佳，使其容易感染各種疾病。但本次研究結(jié)果卻顯示兩者病毒檢出率無明顯差異。分析原因?yàn)楸敬稳脒x的患兒均是存在上呼吸道感染癥狀的患兒，且研究時(shí)間較短，故檢出率無明顯差別。如要系統(tǒng)研究二者的區(qū)別，應(yīng)擴(kuò)大樣本遠(yuǎn)期隨訪，通過固定入選人員，結(jié)合在一定時(shí)間內(nèi)感染的次數(shù)、感染后的癥狀、感染后持續(xù)的時(shí)間、治療手段及輔助檢查結(jié)果等多方面系統(tǒng)研究。

本次研究，因時(shí)間、資金等原因，研究的季節(jié)僅限于夏季與冬季，且只有1年。其研究結(jié)果可能存在一定的偏差。但在一定程度上，反應(yīng)了短時(shí)期內(nèi)的呼吸道病毒感染情況，為兒童急性呼吸道感染的診治提供了依據(jù)。

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