TGF-β1和endoglin在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)及意義

王婭南 徐芳 李玉蘭 張順

乳腺癌是當(dāng)今世界女性最多發(fā)的惡性腫瘤，自20世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外乳腺癌發(fā)病率無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，始終處于不同的上升狀態(tài)，乳腺癌其侵襲性和轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因［1］。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與血管生成密切相關(guān)，抑制血管生成成為治療乳腺癌的一個(gè)重要研究方向。血管的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，因而探討眾多因素中相互關(guān)系，有利于各種血管相關(guān)因子地位與主次之分，對(duì)于獲取有價(jià)值的干預(yù)靶位具有肯定價(jià)值。因此，本研究采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)TGF-β1和endoglin mRNA和蛋白在乳腺正常組織、非典型性增生、原位癌及浸潤(rùn)性癌組織中的表達(dá)變化，旨在討論兩者在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步尋找關(guān)鍵靶位提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 取自2008至2010年我院病例，經(jīng)由病理醫(yī)師復(fù)審病理切片。臨床資料和蠟塊保存完整，共210例，其中正常乳腺30例，非典型性增生50例，原位癌50例，浸潤(rùn)性癌80例。病理分類(lèi)依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年病理分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑 鼠抗人endoglin一抗，鼠抗人TGF-β1一抗，SP二抗試劑盒(北京中杉生物公司);Taq酶，dNTPs和引物(endoglin上游 引 物 5 ＇-CGCCGCCACATCAGAAGGCTG-3 ＇，下 游 引 物 5 ＇-CTTTGGTCCAGTCACACCTT-3＇，GAPDH 上游引物 5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3＇，下游引物 5＇-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3＇，擴(kuò)增子分別為805 bp，288 bp)，MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色：參照北京中杉公司SP兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所有切片均同一批完成，以保證實(shí)驗(yàn)條件相同。陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照：0.01 mol/LPBS代替一抗。

1.3.2 RT-PCR反應(yīng)：①RT反應(yīng)用M-MuLV RT酶為反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為 20 μl，37℃，1 h，70℃，10 min。 -20℃ 保存。②PCR反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入 cDNA 2.5μl，上下游引物(20 pmol/L)各 1 μl，總體系 25 μl。endoglin反應(yīng)參數(shù)：94℃5 min，30 個(gè)循環(huán)(94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min)，72℃7 min。GAPDH 反應(yīng)參數(shù)：94℃5 min，30 個(gè)循環(huán)(94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s)，72℃7 min。凝膠成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行電泳條帶的分析，測(cè)量每一條帶的密度，并將其與內(nèi)參(GAPDH)的吸光度相比，求相對(duì)的量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)和相關(guān)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Endoglin蛋白的陽(yáng)性信號(hào)主要定位于新生的內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，且新生血管分布不均勻，大多數(shù)局限于腫瘤實(shí)質(zhì)邊緣的間質(zhì)內(nèi)。新生血管呈點(diǎn)、線、簇狀結(jié)構(gòu)，有管腔樣結(jié)構(gòu)形成，腔不規(guī)則，壁薄而無(wú)平滑肌形成。Endoglin蛋白在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與患者年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)。Endoglin蛋白在正常組、不典型增生組、原位癌及浸潤(rùn)性癌組的表達(dá)，兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，且在癌巢邊緣的癌細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，大部分血管內(nèi)皮細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá)。在正常乳腺組TGF-β1蛋白表達(dá)于少量血管內(nèi)皮細(xì)胞;在非典型性組表達(dá)于異常增生的腺上皮細(xì)胞及新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞上。見(jiàn)圖1。

2.3 Endoglin mRNA在正常組、不典型增生組、原位癌及浸潤(rùn)性癌組的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.33±0.19)、(0.78±0.51)、(1.35±0.91)、(3.85±0.87)，兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 不典型增生組、原位癌組及浸潤(rùn)性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標(biāo)記的MVD值及mRNA表達(dá)值有顯著相關(guān)性，TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性組中endoglin蛋白標(biāo)記的MVD值及endoglin mRNA均顯著高于TGF-β1表達(dá)陰性組(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

表1 不典型增生組和原位癌組及浸潤(rùn)性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標(biāo)記的MVD值相關(guān)性比較±s

表1 不典型增生組和原位癌組及浸潤(rùn)性癌組中TGF-β1與endoglin蛋白標(biāo)記的MVD值相關(guān)性比較±s

原位癌組(n=50) 26(+) 47.0±4.6 1.27±0.81 ＜0.05 24(-) 22.5±1.9 0.48±0.19浸潤(rùn)性癌組(n=80) 56(+) 69.5±7.3 4.03±1.11 ＜0.05 24(-)29.8±5.0 0.68±0.13

圖1 免疫組化法TGF-β1與endoglin在乳腺浸潤(rùn)性癌組織中的表達(dá)

圖2 endoglin的RT-PCR結(jié)果

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)乳腺癌發(fā)病率居我國(guó)女性惡性腫瘤的第1位，死亡率占我國(guó)女性死亡率的第3位。乳腺癌的病因?qū)W是多因素的，涉及飲食、生育和激素失衡等。腫瘤的生長(zhǎng)與血管形成關(guān)系密切［2］。血管形成(angiogenesis)是指機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧和炎癥等情況下，原有微血管細(xì)胞(endothelial cell，EC)經(jīng)過(guò)生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重建等形成新毛細(xì)血管的過(guò)程。腫瘤的生長(zhǎng)可分為無(wú)血管期(avacular stage)或稱血管前期(prevascular stage)和血管期(vascular stage)。無(wú)血管期的腫瘤主要依靠周?chē)M織的彌散獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排泄代謝產(chǎn)物，腫瘤細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，如果腫瘤細(xì)胞其增殖率和死亡率幾乎相等，腫瘤體積難以超過(guò)1～2 mm3，也極少發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。如果腫瘤超過(guò)這樣的體積還缺乏新生的毛細(xì)血管和小血管長(zhǎng)入，腫瘤組織將發(fā)生退化，一旦新生血管長(zhǎng)入腫瘤組織，腫瘤就形成的自身的血管系統(tǒng)，即進(jìn)入了血管期。此期的腫瘤局部有大量的新生血管形成，腫瘤細(xì)胞得到充分營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤組織就會(huì)不可控制性生長(zhǎng)及無(wú)限制擴(kuò)張趨勢(shì)，并向周?chē)M織浸潤(rùn)，新生血管的基底膜不完整，血管通透性高以及新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞分泌膠原酶、纖溶酶和纖溶酶原激酶，在其作用下，腫瘤細(xì)胞極易穿透血管壁而發(fā)生周?chē)M織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，血管形成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程發(fā)揮著重要的作用，關(guān)于腫瘤血管形成的機(jī)制一直是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前研究顯示，TGF-β1可能參與了血管的形成［4］。在TGF-β1基因缺失時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞分化發(fā)生缺陷，形成不了足量的內(nèi)皮細(xì)胞管并且管腔不完整。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組、不典型增生組;同時(shí)浸潤(rùn)性癌組TGF-β1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于原位癌組;并且，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，且在癌巢邊緣的癌細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，大部分血管內(nèi)皮細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá)，而在正常乳腺組TGF-β1蛋白表達(dá)僅于少量血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá);在非典型性組表達(dá)于異常增生的腺上皮細(xì)胞及新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，提示在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中，癌細(xì)胞能夠合成TGF-β1，TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)參與了乳腺癌的發(fā)生，可能是檢測(cè)乳腺組織癌變的分子標(biāo)志物。但其具體機(jī)制，目前尚不清楚。Endoglin又名 CD105，分子量為180 kD，由兩個(gè)分子量為95 kD的單體組成的二聚體膜蛋白。Endoglin為內(nèi)皮細(xì)胞上的一種抗原成分，與內(nèi)皮細(xì)胞增生有關(guān)，對(duì)血管形成至關(guān)重要的。Miller等［5］通過(guò)檢測(cè)肺癌細(xì)胞株和各種類(lèi)型的內(nèi)皮細(xì)胞株中endoglin mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有腫瘤細(xì)胞株均未檢測(cè)到endoglin mRNA，而所有的內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)一定數(shù)量的endoglin mRNA，這包括從肺癌組織中分離出來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了endoglin選擇性的表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。

在乳腺不典型增生、原位癌和浸潤(rùn)癌組中，Endoglin mRNA及蛋白表達(dá)均與TGF-β1蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示Endoglin和TGF-β共表達(dá)參與了乳腺癌癌變過(guò)程，可能具有協(xié)同作用。惡性腫瘤的MVD與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系，腫瘤中血管的定量被認(rèn)為是一種重要而獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)［6］。

目前用于標(biāo)記腫瘤組織微血管的試劑主要為泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31、CD34抗體及FⅧ-RA等，但它們?cè)谀[瘤組織的活性增生性微血管中的表達(dá)有時(shí)并不穩(wěn)定，因而在判斷MVD預(yù)后生存意義上存在差異。隨著乳腺良性病變向乳腺癌方向的發(fā)展，血管不斷形成和增生，血管密度也不斷增加，特別在MDC階段，說(shuō)明一旦腫瘤細(xì)胞突破基底膜，瘤細(xì)胞更能刺激新生血管的生長(zhǎng)，加速乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［7］。乳腺癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后不良，當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，5年生存率由98%大幅下降至27%。如果在腫瘤發(fā)生時(shí)能控制早期癌，甚至是處在浸潤(rùn)性癌前期病變時(shí)就能控制病程發(fā)展，將會(huì)帶來(lái)廣闊的控制、治療乳腺癌的前景。

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