HIF-1α在前列腺癌組織中的表達及與MVD的關(guān)系

閆紅麗 張偉 安豐 張金立 鄭冰 田紅英 王薇

前列腺癌(prostatic cancer，PCa)是男性泌尿系統(tǒng)常見腫瘤。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是介導(dǎo)細胞對缺氧環(huán)境進行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［1］。其在多種惡性腫瘤及癌前病變中呈過度表達狀態(tài)，被認為是腫瘤血管形成環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵啟動因子［2-4］。腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是指對腫瘤血管最密集部位所進行微小血管計數(shù)，是目前最能反映腫瘤血管形成能力的指標之一，它與多種腫瘤的惡性行為、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。國內(nèi)對于HIF-1α與MVD之間的關(guān)系，目前尚無定論。本研究采用免疫組化SP法，對不同病理分級的72例前列腺癌組織HIF-1α進行檢測、用八因子相關(guān)抗原(Ⅷ-R-Ag)標記MVD，探討HIF-1α與前列腺癌血管生成的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科2006年6月至2011年12月手術(shù)切除前列腺癌組織、前列腺針吸活檢癌組織72例;患者年齡59～71歲，平均年齡61.12歲。術(shù)后立即取材，經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片4張，常規(guī)HE染色行病理組織學(xué)診斷，按世界衛(wèi)生組織(WHO)建議使用的Mostofi分級方法，其中高分化20例，中分化28例，低分化24例。

1.2 主要儀器及試劑 Leica RM2125轉(zhuǎn)輪石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司)、光學(xué)顯微鏡型號893799(日本OLYMPUS公司)。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司);兔抗人八因子相關(guān)抗原(Ⅷ-R-Ag)多克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司);SP免疫試劑盒和羊血清(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。一抗稀釋度：兔抗人Ⅷ-R-Ag多克隆抗體1∶200。H1F-1α為工作液。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 采用Streptavidin Peroxdase Conjugated Method即SP法進行免疫組織化學(xué)染色，檢測前列腺癌組織中HIF-1α的表達情況，并用Ⅷ-R-Ag標記前列腺癌組織MVD。實驗步驟：切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。以3%H2O2溶液室溫下孵育10 min。將切片置于0.01 mmol/L枸椽酸鈉緩沖液(pH值6.0)中或0.01 mmol/L EDTA組織抗原修復(fù)液(pH值8.0)中，醫(yī)用微波爐抗原熱修復(fù)。滴加正常山羊血清10μl。滴加適當比例稀釋的一抗，4℃過夜(16～18 h)。加入生物素標記二抗。加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。取二氨基苯聯(lián)胺(DAB)試劑盒中的A、B、C三種試劑，滴入1 ml去離子水中混勻，滴加溶液顯色。蘇木素染細胞核，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 以陽性腫瘤細胞的百分比和染色強度綜合評價判斷免疫組化染色結(jié)果。陽性腫瘤細胞百分比通過400倍高倍鏡下至少5個視野確定，按以下5個范圍計分：陽性細胞百分數(shù)評分分別為：0分(0～4%)，1分(5～24%)，2分(25～49%)，3分(50～74%)和4分(75～100%)。腫瘤細胞免疫染色的強度計分：無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;陽性腫瘤細胞的百分比和染色強度乘積的加權(quán)數(shù)，即免疫組化染色指數(shù)=陽性細胞百分數(shù)×染色強度。標準：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中等陽性(++)，4分以上為強陽性(+++)。MVD：用八因子相關(guān)抗原單克隆抗體標記血管內(nèi)皮細胞，癌細胞間質(zhì)內(nèi)有孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細胞、細胞簇或血管腔面積小于8個紅細胞，且管壁無肌層代表1條單獨的微血管。先在低倍視野下找腫瘤組織內(nèi)MVD最高區(qū)域，然后在200倍視野下計數(shù)3個視野內(nèi)的微血管數(shù)，再將總數(shù)除以3，取其平均值作為腫瘤該視野下的MVD。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α在前列腺腫瘤細胞的表達情況 HIF-1α在腫瘤細胞胞核進行表達，部分腫瘤細胞胞質(zhì)可見少量表達，其在腫瘤組織邊緣或與正常組織交界處的細胞及壞死的腫瘤組織中多見。分化程度高的前列腺癌細胞胞核多數(shù)有棕黃色細顆粒，染色淡，陽性細胞少;分化程度低的前列腺癌細胞胞核棕黃色，著色較深，陽性細胞數(shù)目多。

2.2 不同級別前列腺癌組織HIF-1α的陽性表達及相關(guān)性本組72例前列腺癌組織HIF-1α的表達陽性率為69.4%(50/72)。在高分化、中分化和低分化的前列腺癌組織中HIF-1α的陽性表達率分別為95.83%、64.29%和45.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=52.06，P＜0.01)。HIF-1α的表達和前列腺癌的病理分級有相關(guān)性(r=0.49，P＜0.05)，分化程度越低，HIF-1α表達越高。見表1，圖1～3。

表1 前列腺癌組織HIF-1α的表達與病理分級關(guān)系 例

圖1 低分化前列腺癌細胞中HIF-1α表達(SP×400)

圖2 中分化前列腺癌細胞中HIF-1α表達(SP×400)

圖3 高分化前列腺癌細胞中HIF-1α表達(SP×400)

2.3 前列腺腫瘤微血管形態(tài)表現(xiàn) 內(nèi)皮細胞形態(tài)各異，以大量芽狀或細索狀血管為主，血管床數(shù)目增多，分支紊亂，管腔不規(guī)則，管腔擴張或狹窄、變形，并缺乏完整的基底膜。

2.4 MVD在不同級別前列腺癌組織中的計數(shù)情況 MVD在高分化、中分化和低分化的前列腺癌組織中分別為11.40±2.70，29.00±1.87，49.20±2.86，MVD 在各級別前列腺癌組織之間表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=282.45，P＜0.01)。

2.5 前列腺癌組織中HIF-1α的表達與MVD的關(guān)系 HIF-1α陽性表達組前列腺癌組織中MVD為48.20±3.27，HIF-1α陰性表達組的前列腺癌組織MVD為14.00±2.73，HIF-1α陽性組明顯高于HIF-1α陰性組(F=321.73，P ＜0.01)。MVD的數(shù)值與HIF-1α的染色積分呈正相關(guān)(r=0.65，P＜0.05)。

3 討論

HIF-1是一個具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它通過與靶基因的缺氧元件結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞對缺氧的適應(yīng)反應(yīng)［6，7］。HIF-1由HIF-1α和HIF-1b兩種亞單位構(gòu)成。HIF-1α可能通過刺激腫瘤血管新生、維持腫瘤細胞能量代謝、促進腫瘤增值等引起腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。Zhong等［8］對14例高級別前列腺上皮內(nèi)瘤變組織進行免疫組化分析研究，發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達明顯增高。所以推斷HIF-1α可能是潛在性評估前列腺癌前病變的生物標記物，有可能成為新的治療靶點。Lekas等［9］報道與良性前列腺增生比較HIF-1α在前列腺癌組織中呈過度表達狀態(tài)。HIF-1α在晚期前列腺癌病例中發(fā)現(xiàn)其表達明顯上調(diào)［10］。其發(fā)病機制尚不明了。本研究證實HIF-1α在前列腺癌組織中呈過度表達狀態(tài)，其臨床分化越低其表達率越高。以上結(jié)果表明HIF-1α參與前列腺癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

腫瘤新生血管的生成在其發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最重要的血管內(nèi)皮生成誘導(dǎo)因子，它能夠促進血管內(nèi)皮細胞成熟并增加通透性。MVD是新生血管的重要衡量指標，與腫瘤細胞的增值和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。本研究證實微血管密度隨著前列腺癌的惡性程度增加而增大，惡性程度越高微血管密度越大。反映出MVD與前列腺癌的分化程度相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)以Ⅷ因子相關(guān)抗原染色腫瘤組織中腫瘤微血管的形態(tài)的特征，符合腫瘤組織微血管特點，腫瘤內(nèi)新生血管以大量芽狀或細索狀血管為主，血管床數(shù)目增多，分支紊亂，管腔不規(guī)則，管腔狹窄、擴張或變形，且缺乏完整的基底膜，并且在部分高度惡性前列腺癌中，會出現(xiàn)腎小球狀血管，內(nèi)皮細胞的形態(tài)各異，呈現(xiàn)腫瘤新生血管的特征。微血管密度最高區(qū)域多數(shù)位于瘤組織與正常組織交界處，即所謂“浸潤邊緣”，所以該處是腫瘤細胞生長浸潤最活躍的部位，這提示高密度的微血管能夠給周邊瘤細胞提供更充足的養(yǎng)分，從而加強浸潤能力。同時，發(fā)現(xiàn)瘤旁區(qū)到正常區(qū)的微血管形態(tài)逐漸規(guī)整，數(shù)量呈逐漸減少。腫瘤新生血管基底膜缺乏或不完整，管壁薄弱，平滑肌不完整，故此血管結(jié)構(gòu)易于發(fā)生自發(fā)性出血，有利于前列腺癌細胞穿過血管壁進入循環(huán)系統(tǒng)，是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的第一站，同時也是腫瘤血管促進轉(zhuǎn)移的原因之一。因此前列腺癌血管生成不僅為腫瘤細胞離開原發(fā)灶進入循環(huán)提供途徑，也為轉(zhuǎn)移瘤的生了長創(chuàng)造條件，反映出腫瘤的侵襲性與誘導(dǎo)血管形成能力是平行的。

本研究通過分析HIF-1α與MVD的相關(guān)性證實HIF-1α和微血管密度密切相關(guān)，因此有可能HIF-1α作為缺氧的固有標志，將為腫瘤提供一個更為準確的檢測手段和治療靶點。這也提示臨床可通過阻斷HIF-1α的生成或促使其降解來降低前列腺癌細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，為前列腺癌的治療提供一種新思路。

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