胃癌Livin和Survivin表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性分析

曹曉靜 趙莉 王志敏 宋曉昕 杜麗艷

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，極大危害了人類健康。近年來(lái)研究表明，腫瘤的形成與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員通過(guò)不同途徑抑制細(xì)胞凋亡，凋亡機(jī)制受到抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要促進(jìn)因素。目前發(fā)現(xiàn)的IAP家族有8個(gè)成員，其中Livin和Survivin作為新近發(fā)現(xiàn)的成員最令人們關(guān)注。本研究檢測(cè)了Livin和Survivin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，并對(duì)兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，有望為胃癌的診斷和治療開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 2005年3月至2007年6月經(jīng)手術(shù)切除胃組織標(biāo)本，其中胃癌82例，正常胃組織(非腫瘤性疾病)11例，標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理證實(shí)。其中河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院胃癌38例，正常胃組織(非腫瘤性疾病)11例，邢臺(tái)市第一醫(yī)院(即邢臺(tái)市腫瘤醫(yī)院)胃癌44例，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及免疫藥物等抗腫瘤治療措施，有完整的臨床病理資料。其中男52例，女30例;年齡25～81歲，平均年齡58歲。UICC分期：Ⅰ、Ⅱ期26例，Ⅲ、Ⅳ期56例。腫瘤直徑＜5 cm 26例，≥5 cm 56例。T1、T2標(biāo)本34例，T3、T4標(biāo)本48例。組織學(xué)類型為：高、中分化31例，低分化、未分化癌51例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。

1.2 主要試劑 Livin兔多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司，Survivin兔多克隆抗體購(gòu)于Zemet公司，SP-9001工作試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 采用免疫組化過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素法(SP)，工作濃度 Livin 為1∶50，Survivin 為1∶50。以 PBS 溶液代替一抗做空白對(duì)照，均采用微波抗原修復(fù)。

1.4 結(jié)果判定 按照半定量積分方法，每例每個(gè)指標(biāo)隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)，根據(jù)免疫組化染色反應(yīng)的深度及陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量分別記分，其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)。淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，不著色為0分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分，并根據(jù)這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)分為4級(jí)，即0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)胃癌組織中Livin和Survivin蛋白的表達(dá)及相關(guān)性進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中Livin的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系 鏡下Livin主要定位于胃癌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，為棕黃色顆粒。82例胃癌中陽(yáng)性表達(dá)50例(60.9%)，在11例正常胃組織無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(0%)。胃癌中Livin的表達(dá)明顯高于正常胃組織(χ2=14.507，P＜0.05)。Livin的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，在高中分化胃癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為45.2%，低分化及未分化組陽(yáng)性表達(dá)率為70.6%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織表達(dá)率為41.7%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率為68.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.239，P＜0.05)。但與患者的年齡、性別比、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度及TNM分期臨床病理因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表 1，圖 1、2。

2.2 胃癌中Survivin的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系 鏡下Survivin主要定位于胃癌的細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色顆粒。82例胃癌中有57例為陽(yáng)性表達(dá)(69.5%)，Survivin的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期臨床病理因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)。在11例正常胃組織中，Survivin蛋白陽(yáng)性1例(9.1%)，胃癌中Survivin的表達(dá)明顯高于正常胃組織(χ2=15.086，P ＜0.05)。見(jiàn)表1，圖3、4。

2.3 胃癌中Livin和Survivin表達(dá)的相關(guān)性 在胃癌中Livin表達(dá)陽(yáng)性50例中，Survivin同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)32例，在32例Livin陰性表達(dá)者中，Survivin同時(shí)陰性7例，未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯相關(guān)關(guān)系(χ2=1.873，P ＞0.05)。

表1 胃癌組織中Livin和Survivin表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系例(%)

圖1 Livin在胃癌組織中的表達(dá)(SP×400)

圖2 Livin在正常胃組織中的表達(dá)(SP×400)

圖3 Survivin在胃癌組織中的表達(dá)(SP×400)

圖4 Survivin在正常胃組織中的表達(dá)(SP×400)

3 討論

腫瘤的形成和發(fā)展與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。近年來(lái)凋亡抑制蛋白(IAP)作為一種重要的抗細(xì)胞凋亡因子，日益受到人們的重視。目前發(fā)現(xiàn)的人類IAP家族有8個(gè)成員，分別是NIAP、XIAP、cIAP-1、cIAP-2、Survivin、apollon、ILP-2 和 Livin［1］。該家族的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為：N端含有一個(gè)或多個(gè)(目前最多為3個(gè))串聯(lián)的桿狀病毒 IAP重復(fù)序列(baculovirus IAP repeat，BIR)，C端含有或不含有一個(gè)環(huán)指(ring finger)結(jié)構(gòu)?？沟蛲龅闹饕Y(jié)構(gòu)為BIR。

Livin是2000年由4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)小組幾乎在同一時(shí)期所發(fā)現(xiàn)的。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長(zhǎng)4.6kb，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。目前發(fā)現(xiàn)Livin的抗凋亡途徑：(1)通過(guò)調(diào)控Caspase信號(hào)途徑，直接或間接與Caspase-3、7、9結(jié)合，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡效果［2］;(2)激活TAK1/JNK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制細(xì)細(xì)胞凋亡［3］;(3)Livin與Smac/DLABLO相互制約，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［4］。Livin在正常成人大多數(shù)終末分化組織中低表達(dá)或不表達(dá)，而特異性高表達(dá)于某些腫瘤組織。在惡性腫瘤中，如結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、腎癌、白血病等，Livin均呈高表達(dá)［5-13］。

Survivin又名存活素，是1997年由Ambrosini G等，用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1cDNA在人類基因組庫(kù)的雜交篩選中首先分離出來(lái)。Survivin基因定位于染色體17q25，有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，Survivin只包含一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，并不包含RING。Survivin作用是：直接或間接與Caspase-3，7結(jié)合抗細(xì)胞凋亡作用;參與細(xì)胞增殖、分裂和細(xì)胞周期的調(diào)控作用;參與血管形成作用。Survivin的組織分布是在胚胎發(fā)育期間表達(dá)，終末分化組織中不表達(dá)，但在很多的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和人的腫瘤中表達(dá)。

研究顯示Livin和Survivin其抑制細(xì)胞凋亡作用較強(qiáng)，并特異性高表達(dá)于某些腫瘤組織［12］。近年來(lái)，Livin在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展［13］，但兩者同時(shí)在胃癌組織中的研究尚不多，我們進(jìn)行了這方面的研究。

我們的研究結(jié)果顯示，82例胃癌中陽(yáng)性表達(dá)50例(60.9%)，11例正常胃組織無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(0%)，胃癌組織中Livin表達(dá)明顯高于正常胃組織(P ＜0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道［14，15］基本一致：說(shuō)明Livin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)上調(diào)可能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌發(fā)生和發(fā)展。Livin表達(dá)破壞了細(xì)胞的增殖和凋亡之間的平衡，在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用，使腫瘤細(xì)胞凋亡不足，促使惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞異常增多，為腫瘤的發(fā)生提供了有利條件。Livin表達(dá)與腫瘤組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度及TNM分期臨床病理因素?zé)o關(guān)(P＞0.05)，而有報(bào)道，Livin表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)［16］，但是我們研究未顯示有明顯關(guān)系，可能與其進(jìn)行了Livin蛋白的定量研究有關(guān)。研究說(shuō)明，Livin過(guò)表達(dá)于胃癌組織中，表達(dá)的增高，提示組織分化程度的降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性的增高。因此Livin今后可能作為評(píng)估胃癌臨床生物學(xué)行為的指標(biāo)，但與胃癌預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步深入的研究。

我們研究發(fā)現(xiàn)：Survivin在82例胃癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)57例，陽(yáng)性率69.5%，明顯高于正常胃組織9.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，與報(bào)道［17］一致。但 Survivin的表達(dá)與患者的年齡、性別比、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、組織分化程度、TNM分期臨床病理因素?zé)o關(guān)。研究說(shuō)明在胃癌中Survivin過(guò)度表達(dá)，因而造成細(xì)胞增殖增加，凋亡減少，細(xì)胞增殖與凋亡平衡被打破，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

Livin和 Survivin同屬IAP家族成員，均可直接作用于Caspase-3和Caspase-7，實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡作用，但是二者在抗凋亡功能上并非完全相同，它們?cè)谀[瘤的形成中是否存在相關(guān)性，目前尚不確切。我們本次研究顯示，胃癌中Livin和Survivin的表達(dá)均顯著高于正常胃組織(P＜0.05)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。研究表明，Livin和Survivin在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在不同作用機(jī)制，我們期望有更深入的研究。

綜上所述，Livin、Survivin在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。通過(guò)抑制IAP家族成員的表達(dá)，尤其是Livin、Survivin將是以后腫瘤凋亡治療研究的突破點(diǎn)。隨著科學(xué)的突飛猛進(jìn)，研究的不斷深入，Livin、Survivin不但可能作為胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物，并將為胃癌的基因治療，免疫治療提供新的靶點(diǎn)。

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