循環(huán)活化血小板的檢測(cè)在腦梗死患者診斷與治療中的臨床研究

劉京偉

(山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東臨沂276400)

腦梗死(cerebralinfarction，CI)多在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)生，CI的重要病理基礎(chǔ)為血管內(nèi)血栓形成。血小板活化與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。由于纖維蛋白原受體(fibrinogenreceptor，F(xiàn)BI－R)和P－選擇素均可作為血小板活化的分子標(biāo)志物，為此，觀察121例CI患者循環(huán)活化血小板膜表面FBI－R和P－選擇素的變化情況，旨在探討其與CI之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象:入選121例CI患者均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1］。根據(jù)CT報(bào)告將其分為大面積梗死組(＞5cm2)41例，小面積梗死組(≤5cm2)52例，以及腔隙性梗死組28例，其中男73例，女48例，平均年齡(60.8±10.6)歲。對(duì)照組為同期體檢未發(fā)現(xiàn)異常的健康人70例，其中男42例，女28例，平均年齡(60.4±11.3)歲。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器:FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2.2 主要試劑:①單克隆抗體(monoclonalanti body，McAb)包括異硫氰酸熒光素(fluoreszeinsothiocyanat，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗血小板纖維蛋白原受體(FIB－R)的McAb(PAC－1FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗P－選擇素的 McAc(CD62PPE)、Peridinin葉綠素蛋白(PerCP)標(biāo)記的抗血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(CD61PerCP)、MIgGPE為藻紅蛋白標(biāo)記的鼠IgG，以上均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。②流式細(xì)胞儀熒光校準(zhǔn)微球，美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2.3 精氨酰－天冬氨酰－絲氨酰多肽(ArgGly－Asp－Ser，RGDS)(FIB－R阻斷劑)、人工合成的RGDS肽，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集:所有CI患者急性發(fā)作24h內(nèi)采集肘靜脈血2mL，其余均為晨起空腹采集，經(jīng)106mmol/L枸櫞酸鈉抗凝。

1.3.2 抗血小板McAc免疫熒光染色:在陰性對(duì)照管中加入PAC－1FITC、MIgGPE、RGDS和CD62PPE 和CD61Per-CP各10μL測(cè)定管中加入PAC－1FITC、CD62PPE和CD61 PerCP各10μL，然后加入5μL抗凝血混勻，置室溫，避光反應(yīng)20min，立即加入1%多聚甲醛(2～6℃)1mL并混勻，置4℃冰箱保存，24h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析活化血小板:用熒光微球校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀后，將上述用熒光素標(biāo)記的抗血小板McAb免疫熒光染色的標(biāo)本在流式細(xì)胞儀上測(cè)定，記數(shù)1萬(wàn)個(gè)血小板，以CD61PerCP和側(cè)向散射光雙參數(shù)設(shè)定血小板門(mén)，分析FIBR(PAC－1)和CD62P陽(yáng)性血小板百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)原理:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件APSS10.0For Windows，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以M(全距)表示，多組間資料分析采用方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

CI患者較對(duì)照組FIB－R表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是急性期(P＜0.01)，見(jiàn)表1。在不同梗死面積的梗死組之間，F(xiàn)IB－R表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。各組之間P－選擇素表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 CI患者與對(duì)照組循環(huán)血小板膜面積FIB－R和P－選擇素的表達(dá)M %

表2 不同梗死面積CI患者循環(huán)血小板膜面積FIB－R和P－選擇素的表達(dá)M %

3 討論

腦梗死多在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)生，動(dòng)脈粥樣硬化后，由于血管壁內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管膠原暴露與血小板接觸面增加，易導(dǎo)致血管內(nèi)血栓，在這一過(guò)程中血小板的活化起重要作用?；罨“迮c靜止血小板相比，其膜糖蛋白分子的種類、數(shù)量、分布和構(gòu)型等出現(xiàn)顯著變化，流式細(xì)胞技術(shù)作為一種高效、快速、多參數(shù)分析的先進(jìn)技術(shù)，可以非常靈敏地檢測(cè)到活化血小板膜表面糖蛋白分子的變化，從而可以精確判斷血小板的功能狀態(tài)[2］。FIB－R和P－選擇素存在于血小板膜表面，是血小板活化的兩個(gè)較敏感的分子標(biāo)志物。本組研究結(jié)果顯示，CI患者較對(duì)照組血小板膜表面FIB－R的表達(dá)顯著增高，F(xiàn)IB－R增高表明血小板處于活化狀態(tài)，并且在急性期較恢復(fù)期顯著增高，所以活化的血小板是CI的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素[3］。而CI患者血小板膜表面P－選擇素的表達(dá)水平較對(duì)照組未見(jiàn)明顯增高，起因可能是循環(huán)血液中活化血小板膜表面P－選擇素易被清除[4］。同時(shí)Michelson等[5］還證實(shí)P－選擇素被清除的活化血小板仍能繼續(xù)循環(huán)于血液中發(fā)揮其功能。因此P－選擇素并非一種循環(huán)中脫顆粒血小板檢測(cè)的理想標(biāo)志物。另外，F(xiàn)IB－R與CI患者的梗死面積密切相關(guān)，梗死面積越大，F(xiàn)IB－R也越高，預(yù)后也越差。CI患者血小板處于高度活化狀態(tài)，血小板表面質(zhì)膜結(jié)合多種凝血因子，如纖維蛋白原、因子Ⅴ、因子Ⅺ等，可以使活化的血小板與中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞黏附聚集，可促進(jìn)血中纖維素的形成并募集其他白細(xì)胞形成凝塊，是栓子增大，梗死面積增大，病情加重[6］。由于FIB－R增高，血小板活化，產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)如血栓素A2，從而加快栓子的形成。另外CI患者由于缺血、缺氧，病變部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，使血管內(nèi)皮的花生四稀酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎販p少，而前列腺素有抗血小板聚集的功能。動(dòng)態(tài)檢測(cè)CI患者的FIB－R，一方面有助于患者病情輕重程度的判定，另一方面可以了解CI患者血小板的活化情況，即時(shí)調(diào)節(jié)抗血小板治療，以便改善CI的預(yù)后。由于動(dòng)脈粥樣硬化患者中動(dòng)態(tài)檢測(cè)FIB－R，即時(shí)給予抗血小板治療，有助于預(yù)防CI的發(fā)生。

[1]全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議.各類腦血管病診斷要點(diǎn)[J］.中華神經(jīng)科雜志，1996，12(6):379 －380.

[2]王建中，曹凌，賀茂林，等.流式細(xì)胞術(shù)三色分析循環(huán)活化血小板及其在卻學(xué)性腦血管病中的臨床意義[J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2000，80(7):499 －502.

[3]丁志祥，張樂(lè)之，王鴻利.血小板平均面積檢測(cè)的臨床意義[J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2004，25(4):316－318.

[4]Michelson AD，Barnard MR，Hechtman HB， et al． In vion tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface P－ selectin but continue to circulate and function［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1996， 93( 21) : 11877 － 11882．

[5]Michelson AD． Flow cyrometric assessment of glycoprotein movements in platelets［J］． Platelets，1997，8( 2) : 105 － 115．

[6]丁志祥，張樂(lè)之，凌勵(lì).腦梗死病人平均血小板體積的改變及臨床意義[J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2003，1(11):637－638.