腦膠質(zhì)瘤組織中CD133的表達及其與血管形成的關(guān)系

潘 亮，孔令軍，孫建娜，梁朝輝

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州061001;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北滄州061000)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，病因不明確。目前以手術(shù)、放療和化療為主的治療手段已不能治愈腫瘤，腫瘤經(jīng)過一段時間后多會復(fù)發(fā)。CD133是一種分子量為120 ku的細(xì)胞表面蛋白，是目前比較公認(rèn)的腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測不同級別的人腦膠質(zhì)瘤組織中CD133的表達及腫瘤微血管密度(MVD)，旨在進一步明確CD133蛋白水平與膠質(zhì)瘤新生血管形成的關(guān)系，為應(yīng)用抗血管生成療法治療腦膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料:研究對象為手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的46例腦膠質(zhì)瘤患者，男性28例，女性18例，年齡14～65歲，平均42歲。根據(jù)2000年修改的WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)對其進行組織學(xué)的分類分級，其中Ⅰ級7例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例，Ⅳ級8例。另取5例因顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)的正常腦組織作對照，所有膠質(zhì)瘤患者術(shù)前均未接受過化療或放療等輔助治療。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚切片編碼備用。

1.2 主要試劑:兔抗人CD133單克隆抗體(濃縮型)購自博士德公司，SP免疫組化染色試劑盒購自河北博海生物公司，CD34單克隆抗體、DAB試劑盒、PBS緩沖液和檸檬酸鹽抗原修復(fù)液，均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水漂洗3min，切片置0.01mol/L，枸櫞酸緩沖液(PH6.0)中用煮沸(95℃，15～20min)進行抗原修復(fù)，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。取出切片，蒸餾水沖洗2次，3min/次，用 0.01mol/L PBS液沖洗2次共5 min。使用3%雙氧水阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，CD133一抗稀釋度1:200，按照試劑盒說明進行操作(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，甩去PBS液，每張片滴加2滴新配制的DAB溶液(按說明書配制)，3～5min后顯微鏡下觀察顯色情況。蒸餾水充分沖洗，蘇木精輕度復(fù)染1min，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。CD34染色步驟:石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(PH值7.4)沖洗3次，3min/次，切片加入裝有150mL，0.01%枸櫞酸150mL微波抗原修復(fù)8min，涼至室溫30min，3%過氧化氫室溫孵育5min，一抗室溫孵育90min，生物素化二抗室溫孵育10min，DAB孵育5min，復(fù)染、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定:CD133為跨膜蛋白，定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽性，低倍和高倍鏡下觀察并在高倍鏡(400X)下隨機選擇5個視野，計算出陽性細(xì)胞所占的百分率。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):陰性(－)，腫瘤組織完全不著色或陽性細(xì)胞數(shù)小于5%;弱陽性(+)，腫瘤組織陽性細(xì)胞數(shù)6% ～25%;陽性(++)，腫瘤組織陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%;強陽性(+++)，腫瘤組織陽性數(shù)大于50%。平均微血管密度(microvesselsdensity，MVD)的判定和MVD值計數(shù)CD34染色陽性為血管內(nèi)皮細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色。新生血管通常以腫瘤內(nèi)MVD來表示，具體參照Weidner報道的方法。每張切片記錄5個高倍視野下微血管數(shù)目，取其平均值作為該標(biāo)本的MVD(個/視野)，用MVD值表達CD34表達數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法:全部實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理。根據(jù)比較對象的不同，分別使用χ2檢驗和Sperman相關(guān)性分析等方法。

2 結(jié)果

2.1 CD133在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況:本研究46例腦膠質(zhì)瘤組織中CD133總陽性表達率為80.4%，其中強表達6例(13.1%)，中度表達 18 例(39.1%)，弱表達 13 例(28.2%)，不表達9例(19.6%)。CD133表達在不同分化程度組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.885，P ＜0.01)，CD133 表達水平與腦膠質(zhì)瘤病理級別成正向中等程度相關(guān)(r=0.597，P＜0.01)，見表1。隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，CD133陽性細(xì)胞表達明顯增高，見圖1。正常腦組織CD133陰性表達。

表1 CD133的表達與膠質(zhì)瘤分級的關(guān)系 例

圖1 CD133在膠質(zhì)瘤中的表達(SP400X)AWHOⅠ級;BWHOⅡ級;CWHOⅢ級;DWHOⅣ級

2.2 腫瘤微血管密度(MVD)檢測:不同級別的膠質(zhì)瘤組織中MVD值，見表2，各組間總體存在差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.204，P ＜0.01)，進一步進行兩兩比較，除Ⅲ級與Ⅳ級之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義外(χ2=3.824，P ＞0.05)，其余各級之間均存在差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各級別膠質(zhì)瘤組織中MVD染色，見圖2。

表2 膠質(zhì)瘤組織MVD與病理級別的關(guān)系

2.3 CD133表達強度與腫瘤MVD的關(guān)系:對表達不同強度CD133的膠質(zhì)瘤組織中的MVD情況進行分析發(fā)現(xiàn)隨著CD133蛋白表達強度的增加，MVD值呈上升趨勢，見表3。

圖2 CD34在膠質(zhì)瘤中的表達(SP400X)AWHOⅠ級;BWHOⅡ級;CWHOⅢ級;DWHOⅣ級

表3 膠質(zhì)瘤組織中CD133表達與MVD的關(guān)系

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤中CD34－MVD值與CD133陽性細(xì)胞的表達成正相關(guān)性。在低級別腦膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤中CD133陽性細(xì)胞表達很低，以零星分布。而在高級別腦膠質(zhì)瘤組織切片上可見數(shù)個細(xì)胞聚集在一起，并多數(shù)是圍繞著血管或在血管旁，而且見到的巢狀分布的均近血管邊緣。

微血管作為腫瘤干細(xì)胞生存微環(huán)境的重要組成，不僅供應(yīng)了TSC生長所需的營養(yǎng)，還提高了TSC的自我更新和增殖能力。內(nèi)皮細(xì)胞不僅能通過分泌細(xì)胞因子維持TSC的特性[1］，而且一些研究顯示內(nèi)皮在TSC的抗化療、放療中起著非常重要的作用。同時，TSC也促進微血管的形成。Bao[2］通過體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)TSC與普通腦腫瘤細(xì)胞種植形成的腫瘤在外觀及病理特征上存在顯著差異，前者形成的腫瘤血供更豐富，壞死和出血更多。因此，腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖必須有微血管的支持，而腫瘤干細(xì)胞的增殖又可刺激微血管的生成。所以，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微血管是相互促進相互依賴的。

TSC與微血管之間相互支持和促進，抗血管生成治療不僅切斷了腦腫瘤生長所需的營養(yǎng)供應(yīng)通道，還可降低TSC的自我更新和增殖能力，而針對TSC治療的同時亦能減少腫瘤的血供，所以進一步探討腫瘤干細(xì)胞和微血管之間的信號傳導(dǎo)，將為進一步了解TSC的生物學(xué)特性提供了新的方向和靶向治療TSC、微血管打開新的局面。

[1]McKayR． Stem cells in the central nervous system［J］． Science，1997，276: 66 － 71．

[2]Bao S，Wu Q，Sathornsumetee S， et al． Stem cell － like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor［J］． Cancer Res， 2006， 66( 16) : 7843 － 7848．