二氫楊梅素-鎳配合物的合成及抗菌活性的研究

楊 文，李海霞，陳麗珍，翟銳銳

（1.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南?？?71199；2.海南醫(yī)學院藥學院，海南?？?571199）

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種重要的黃酮類化合物，是一種具有廣泛生物活性的重要中藥有效成分，并且是一種重要的功效添加成分，其結構具有超高的離域度、完整的大π鍵共軛體系及強配位氧原子與合適的空間構型，與金屬離子具有較強的螯合作用。研究報道[1-2]，黃酮類金屬配合物的生物活性通常與金屬中心離子的性質有關，且黃酮類與金屬離子螯合生成配合物后生物活性增強，甚至有新的藥理活性產生。二氫楊梅素（DMY）是具有抗菌、抗病毒、護肝、抗氧化、影響肝內重要的藥物（毒物、致癌物）代謝酶細胞色素P450等作用的黃酮類化合物[3-4]。鎳是所有生命體必需的微量元素，主要作用是激活人體中的各種酶，具有獨特的協(xié)調和催化電子轉移特性，對維持人體生理功能起重要作用[5-6]。本文利用天然產物藤茶有機活性成分二氫楊梅素，考察二氫楊梅素配合鎳的合成、表征及其對臨床常見的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌的抗菌活性，為其他天然產物的藥物及食品添加劑研制開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶 產地廣西；二氫楊梅素 為實驗室自制[7]；乙酸鎳 西隴化工股份有限公司，分析純；無水乙醇廣州化學試劑廠，分析純；水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基 杭州天和微生物試劑有限公司。

JASCO-FI-IR-4100型傅立葉變換紅外光譜儀華洋科儀公司；AE 100型電子分析天平 蘇州市萊頓科學儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司；SHB-B95A型循環(huán)水式真空泵 西安太康生物科技有限公司；全自動高壓蒸汽滅菌器美國致微（廈門）儀器公司；生化培養(yǎng)箱 上海博迅儀器有限公司；DZF-6021型真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；三口燒瓶。

1.2 配合物的合成

將0.3202g（1mmol）二氫楊梅素加入50mL無水乙醇，在100mL的圓底燒瓶中于50℃加熱攪拌溶解。加入無水醋酸鈉，反應一定時間，調反應液的pH為7.5；按摩爾比1∶1加入乙酸鎳（1mmol），攪拌回流6h。冷卻至室溫，抽濾，用無水乙醇反復洗滌沉淀，然后于50℃真空干燥10h，得土黃色固體。

1.3 抑菌方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 按試劑使用說明進行配制并高壓滅菌處理，4℃冷藏備用。

1.3.2 實驗藥物的配制 二氫楊梅素金屬鎳配合物DMY-Ni的配制：稱取0.0400g，加入1.8%鹽酸3滴助溶，加無菌注射用水定容至50mL，藥物的最終濃度800μg/mL。二氫楊梅素DMY的配制：稱取0.0400g，熱溶于50mL蒸餾水中，藥物的最終濃度800μg/mL。分別稱取以上兩種合成藥物DMY-Ni和DMY，并配成藥物終濃度為800μg/mL，經115℃10min高溫滅菌處理備用。

1.3.3 活化菌種 斜面活化菌種，37℃培養(yǎng)18～20h后接種至MH瓊脂平板，酵母菌28℃48h接種至沙氏瓊脂平板。

1.3.4 菌懸液的制備 取傳出新鮮菌株編號排序，并分別制成相當0.5麥氏單位標準比濁管濃度菌液，再用液體培養(yǎng)基稀釋成105CFU/mL實驗菌液備用。

1.3.5 最低抑菌濃度（MIC）測定采用 試管二倍稀釋法進行，分別取上述藥物DMY-Ni和DMY，在無菌條件下用MH肉湯分別以二倍稀釋法將藥物稀釋，使各藥物含有不同濃度的應用液，分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125μg/mL共10個濃度，每管1mL。同樣方法用沙氏液體培養(yǎng)基將藥物稀釋成10個濃度。同時設藥物空白、陰性、陽性對照管。在上述10個不同濃度及陽性對照管中，每管加入實驗菌液0.1mL，充分混勻，置37℃培養(yǎng)18～20h，觀察并記錄結果。酵母菌置28℃培養(yǎng)48h，觀察并記錄結果。以藥物空白管、陰性對照管無菌生長，無藥陽性對照管菌株生長良好，標準株（ATCC）為對照。以肉眼觀察無菌生長的試管中所含藥物的最低濃度即為最低抑菌濃度，重復3次。

1.3.6 最低殺菌濃度（MBC）測定 將未見細菌或真菌生長管，每管取出0.1mL培養(yǎng)液接種于相應的固體培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)18～20h，觀察并記錄結果。酵母菌置28℃培養(yǎng)48h，觀察并記錄結果。在藥物空白管、陰性對照管無菌生長，陽性對照管菌株生長正常的條件下，凡接種的平板上菌落少于5個或未見細菌生長的最低藥物濃度即為MBC，重復3次。

2 結果與討論

2.1 二氫楊梅素-鎳金屬配合物的表征

2.1.1 配合物的紅外光譜 采用KBr壓片法，對DMY-Ni配合物進行紅外光譜掃描，結果見圖1。由圖1可知，3426.89cm-1是苯環(huán)上的羥基O-H伸縮振動吸收，說明配合物存在羥基；2368.12cm-1歸屬于苯環(huán)上的C-H伸縮振動吸收；二氫楊梅素在1641.45cm-1處有強吸收峰，這是由于4位羰基與5位羥基偶合作用，形成二氫楊梅素-鎳（Ⅱ）配合物后，由于金屬離子成鍵作用，使得4位羰基碳氧雙鍵更弱，吸收峰位置移至1592.91cm-1處，向低波數(shù)移動了48.54cm-1；配合物和二氫楊梅素的ν（C-O-C）相比，變化較小，也表明了C環(huán)上的氧并未與金屬離子發(fā)生作用；配合物在608.43cm-1處出現(xiàn)了ν（O-M），說明鎳離子與二氫楊梅素發(fā)生了作用并形成以Ni-O鍵結合的二氫楊梅素-鎳配合物。

2.1.2 紫外光譜 以二甲基亞砜為溶劑，測量了二氫楊梅素及其鎳配合物的紫外光譜，見圖2～圖3。由圖2知，二氫楊梅素在292.5nm處有最大吸收峰，與Ni（Ⅱ）配位后，其在308nm處出現(xiàn)最大吸收，最大吸收峰紅移了15nm，證明鎳與二氫楊梅素形成了配合物，使其二氫楊梅素的結構發(fā)生了改變。

表1 二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌情況（n=3）Table 1Antibacterial activity of DMY-Ni（n=3）

2.1.3 熱重分析 二氫楊梅素鎳配合物的熱重分析見圖4。配合物的第一失重階段在50～150℃之間，失重率為22.45%，此階段失重的水為配合物分子外的結晶水，與失去7個水分子的量相當。第二個階段從220～550℃，配體迅速燃燒分解，為骨架斷裂峰，失重率為65.57%，與失去1個配體分子及兩個氯原子相當。最終分解產物是鎳的氧化物。推測配合物的組成為[Ni（C15H11O8）Cl2]·7H2O。

2.2 二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌活性

試管液體隨藥物濃度降低，菌株生長梯度抑制程度下降，證明實驗成功，結果可靠。二氫楊梅素及二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌及殺菌結果見表1～表3。

由表1～表3可知，二氫楊梅素-鎳配合物對所測白假絲酵母菌均顯示出較強的抑菌和殺菌作用，白假絲酵母菌MIC為6.25～12.5μg/mL，MBC為6.25～25μg/mL，但對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌無明顯的抑制和殺菌作用。而二氫楊梅素對所測的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有一定的抑菌和殺菌作用，其中金黃色葡萄球菌MIC為50～100μg/mL，MBC為50～100μg/mL；大腸埃希菌MIC為200～400μg/mL，MBC為200～400μg/mL，但對白假絲酵母菌無明顯的抑制和殺菌作用。

表2 二氫楊梅素-鎳配合物與二氫楊梅素的MBC值（n=3）Table 2The germicidal dosage of DMY and DMY-Ni（n=3）

表3 二氫楊梅素的抑菌情況（n=3）Table 3 Antibacterial activity of Dihydromyricetin（n=3）

部分金屬的配合物與其配體相比，抗菌活性明顯提高的原因，可能是配合物本身的脂溶性增加，有強烈的滲透到微生物膜內部的特性[8-9]。二氫楊梅素-鎳配合物對白假絲酵母菌顯示出較強的抑菌和殺菌作用，這表明形成配合物后，更容易滲透到白假絲酵母菌膜內部，金屬離子與配體二氫楊梅素可能產生協(xié)同作用，增強了抑菌和殺菌效果[10]。但是配合物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌和殺菌作用不明顯，此結果的闡明，應從殺菌機理入手，有待于進一步研究。

3 結論

二氫楊梅素與鎳離子發(fā)生配位形成二氫楊梅素-鎳（Ⅱ）配合物，根據紅外光譜、紫外光譜及熱重分析的結果，可以推斷配合物的組成為[Ni（C15H11O8）Cl2]·7H2O。二氫楊梅素-鎳配合物對白假絲酵母菌的抑菌作用明顯，這可為臨床疾病的治療提供一個可參考的途徑，但二氫楊梅素-鎳配合物對機體是否存在毒性，有待進一步的體內實驗。二氫楊梅素對細菌（金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌）有不同程度的抑菌和殺菌作用，但對酵母菌無明顯的抑制和殺菌作用，這與之前報道的相一致[11-12]。二氫楊梅素資源豐富，與金屬鎳配合可以發(fā)揮不同的抗菌活性，為黃酮類藥物的研究提供一種新的思路和途徑。

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