李 偉,田 成,汪 滿,程 超
(湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北恩施445000)
火棘(Pyracantha fortuneana)果實(shí),又叫赤陽子、救軍糧,主要分布在我國東南和西南部,也是恩施地區(qū)主要野生植物之一.火棘始載于《滇南本草》,其果實(shí)性味干酸,藥用具有健脾消積、生津止渴、消熱解毒,活血止血等功效[1].黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤癌變、抗心血管疾病等廣泛的生理活性和藥理活性,越來越受到重視[2].
前人對(duì)火棘果黃酮的報(bào)道主要有其清除自由基、降血脂、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)消化等生理功能,此外還對(duì)其中的黃酮類物質(zhì)的種類進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其中主要是槲皮素和蘆丁等[3-5].但系統(tǒng)有效地研究影響火棘果黃酮的得率的因素報(bào)道較少.Plackett-burman設(shè)計(jì)可通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù),從眾多影響因素中篩選出主要的影響因子[6],因此本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用PB實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)火棘果黃酮得率影響最為顯著的因素,并采用中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)影響最為顯著的幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化.此外對(duì)火棘果的體外抗氧化作用進(jìn)行試驗(yàn),以期為火棘的綜合利用提供依據(jù).
火棘果:采摘于恩施市龍洞河成熟火棘果,60℃烘干粉碎備用;乙醚、乙醇、丙酮、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、PG(沒食子酸丙酯)、蘆丁,鄰菲羅啉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社);RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);DL-5型低速大容量離心機(jī)(上海安亭);756MS紫外可見分光光度計(jì)(上海精科).
1.2.1 黃酮含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]對(duì)黃酮含量進(jìn)行測(cè)定.以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,以其質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸光度 A510nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可得回歸方程為 y=0.3991x-0.0178,R2=1.
火棘果黃酮含量測(cè)定:利用乙醚對(duì)火棘果黃酮進(jìn)行脫脂,而后稱取一定量的火棘果粉末,按不同處理進(jìn)行黃酮浸提,將火棘果黃酮浸提液4000r/min離心15min,取上清液定容至25 mL,取0.5 mL,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度值,按下式計(jì)算黃酮得率.
V:測(cè)定時(shí)取樣體積(mL);V總:浸提液總體積(mL);W:火棘果重量(g).
1.2.2 火棘果黃酮的浸提工藝優(yōu)化[8]對(duì)影響黃酮浸提效果的浸提溶劑進(jìn)行優(yōu)化,而后分別對(duì)料液比、原料粉碎粒徑、浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上用PB實(shí)驗(yàn)篩選出影響最為顯著的因素,最后用中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化.
1.2.3 火棘果黃酮的抗氧化作用 按照最佳浸提工藝提取脫脂火棘果的黃酮類物質(zhì),旋轉(zhuǎn)濃縮后,冷凍干燥備用.分別配制一定濃度的火棘果黃酮溶液和PG溶液,按文獻(xiàn)[9-10]的方法測(cè)定對(duì)DPPH、ABTS、·OH的清除作用.
1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS16.0軟件和minitab軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.
對(duì)影響黃酮得率的主要參數(shù)如浸提溶劑、浸提溶劑濃度、料液比、溫度、粒徑、浸提時(shí)間和浸提次數(shù)分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖1.
圖1 單因素對(duì)火棘果黃酮得率的影響Fig.1 The effect of single-factor on extracting rate of flavonoides from Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li Fruits
由圖1可見,丙酮浸提效果優(yōu)于乙醇,隨丙酮濃度增加,黃酮得率增加,當(dāng)丙酮濃度為80%時(shí)達(dá)到最高值,之后開始下降.料液比增加,黃酮得率增加,考慮生產(chǎn)成本,實(shí)驗(yàn)選擇1:60料液比;火棘果黃酮得率隨粉碎目數(shù)增加而增加,當(dāng)粉碎目數(shù)為100目時(shí),黃酮得率達(dá)最高值,隨后下降;黃酮得率隨浸提溫度升高而增加,當(dāng)溫度為70℃,80%丙酮達(dá)沸騰黃酮得率最高;浸提時(shí)間越長(zhǎng),黃酮得率有所增加,但當(dāng)浸提時(shí)間超過1 h時(shí),黃酮得率反而下降.浸提次數(shù)越多,黃酮得率越高,但第二次和第三次黃酮得率差異不顯著(sig.=0.455).
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定PB實(shí)驗(yàn)的因素與水平,具體見表1和表2.
利用minitab軟件對(duì)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,回歸模型系數(shù)的顯著性分析見表3.
表1 Plackett-burman試驗(yàn)參數(shù)與水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-burman experiment
表2 Plackett-burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of Plackett-burman experiment
表3 Plackett-burman試驗(yàn)顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Significant analysis of Plackett-burman experiment
由表3的結(jié)果分析可以看出,粒徑和浸提次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響達(dá)到了極顯著水平(P<0.05),因此選擇這兩個(gè)因素進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn).
在50%丙酮,料液比1∶60,溫度為70℃,1h條件下,對(duì)影響火棘果黃酮浸提的粒徑和提取次數(shù)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4和表5.
回歸方程為 y=64.80+1.482A+8.628B-12.41A2-2.737B2-4.518AB.
表4 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.4 Factors and levels of central composite design
表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.5 Results of central composite design
表6 中心組合實(shí)驗(yàn)的回歸方程的方差分析Tab.6 The variance analysis of central composite design
通過minitab軟件分析得出,火棘果黃酮的最優(yōu)工藝為:粒徑100目,提取次數(shù)2次,在此條件下火棘果黃酮得率的預(yù)測(cè)值為64.80mg/g,實(shí)測(cè)值為65.45mg/g.
2.4.1 對(duì)ABTS和DPPH自由基的清除作用 根據(jù)圖3火棘果黃酮和PG對(duì)ABTS和DPPH自由基清除率的回歸方程可分別計(jì)算出,火棘果黃酮對(duì) ABTS和 DPPH 的IC50為5.874和1.413μg/mL,而PG 對(duì) ABTS和 DPPH 的 IC50為 89.395 和 10.956 μg/mL.由此可見火棘果黃酮對(duì)ABTS和DPPH自由基的清除效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于PG.
2.4.2 對(duì)·OH的清除作用 由圖4中的回歸方程可分別計(jì)算出火棘果黃酮和PG對(duì)·OH 的IC50分別為0.2620和0.064 1 mg/mL,由此可見火棘果黃酮對(duì)·OH的清除效果弱于PG.
圖2 黃酮得率與粒徑和提取次數(shù)的響應(yīng)面Fig.2 The response surface of flavonoid rate and extracting times and particle
圖3 火棘果黃酮和PG對(duì)ABTS和DPPH自由基的清除作用Fig.1 The elimination rate on ABTS and DPPH of PG and flavonoids from Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li Fruits
圖4 火棘果黃酮對(duì)·OH的清除作用Fig4 The elimination effect on OH of flavonoid from Pyracantha fortuneana(Maxim.)Li Fruit
通過PB實(shí)驗(yàn)可以得出,火棘果的粉碎粒徑及提取次數(shù)對(duì)火棘果黃酮得率影響最大,中心組合實(shí)驗(yàn)得出火棘果黃酮的最佳浸提工藝為在50%丙酮,料液比1:60,溫度為70℃,1 h,粒徑為100目,提取兩次,在此條件下火棘果總黃酮得率為65.45mg/g.此外火棘果黃酮對(duì)ABTS和DPPH的自由基清除率高于PG,但是對(duì)·OH的清除率弱于PG.
[1] 李偉,程超,張應(yīng)團(tuán),等.不同火棘果實(shí)功效成分的聚類分析[J].食品科學(xué),2008,29(9):207-210.
[2] Meda A,Lamien C E,Romito M,et.al.Determination of the total phenolic,flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey,as well as their radical scavenging activity[J].Food Chemistry,2005,91(3):571-577.
[3] 程超,李偉,莫開菊,等.不同火棘多酚體外自由基清除作用[J].中國釀造,2008(5):39-42.
[4] 甘秀海,陳華國,周欣,等.火棘果中總黃酮的含量測(cè)定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2012,29(2):1223-1226.
[5] 梁淑芳,馬絨利,馬柏林.火棘黃酮類化合物的提取及微乳薄層色譜分離鑒定[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2003,18(3):60-62.
[6] 王文枝,國偉,代漢慧,等.Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和中心組合法優(yōu)化豆渣膳食纖維提取工藝[J].食品科技,2008(2):219-221.
[7] Liu B,Zhu Y.Extraction of flavonoids from flavonoid-rich parts in tartary buckwheat and identification of the main flavonoids[J].Journal of Food Engineering,2007,78(2):584-587.
[8] 楊冀艷,胡磊,許楊.Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化荷葉總黃酮的提取工藝[J].食品科學(xué),2009,30(6):29-33.
[9] Nessa F,Ismail Z,Mohamed N,et al.Free radical-scavenging activity of organic extracts and of pure flavonoids of Blumea balsamifera DC leaves[J].Food Chemistry,2004,88(2):243-252.
[10] 程超,薛峰,汪興平,等.噴霧冷凍干燥對(duì)葛仙米藻膽蛋白抗氧化特性的影響[J].食品科學(xué),2012,33(13):36-39.