山楂葉總黃酮對糖尿病腎病大鼠腎臟中VEGF表達(dá)影響

劉中柱，盧文婷

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

糖尿病是一種常見的慢性病，發(fā)病率在我國呈逐年上升的趨勢。而糖尿病腎病為糖尿病的全身微血管合并癥之一。國外報(bào)道糖尿病人比非糖尿病人其心血管病和腦血管病的發(fā)生率高2倍以上，腎臟病的發(fā)生率則要高17倍以上[1]。近年來從不同角度的研究說明糖尿病腎病是多種內(nèi)在關(guān)聯(lián)因素參與及影響的結(jié)果，已知的有腎組織糖脂代謝、血流動力學(xué)、血壓、腎小球?yàn)V過屏障、氧化應(yīng)激性、遺傳學(xué)因素、血管活性物質(zhì)以及細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子等異常均能影響該病的發(fā)生發(fā)展。既往已有的實(shí)驗(yàn)研究證明[2]高血脂在腎臟病的發(fā)生中起明顯作用。導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素之一是低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)也起著不可忽視的作用。由此可見VEGF可能也是脂質(zhì)腎毒性的重要介質(zhì)之一。山楂葉總黃酮(flavonoidsin hawthorn leaves，F(xiàn)HL)具有調(diào)節(jié)血脂的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了FHL對糖尿病腎病伴高脂血癥大鼠血VEGF表達(dá)的影響及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

實(shí)驗(yàn)選用2～3月齡，體重180～220g的雄性SD大鼠48只(購自大連醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)動物中心許可證號SCXX(遼)2008－0002)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組(A組)、糖尿病腎病模型組(B組)和山楂葉總黃酮治療組(C組)，每組16只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

B組和C組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素65mg/kg(購自Sigma公司，溶解于10mmol/L枸櫞酸緩沖液中)，48h后連續(xù) 3d尾靜脈測血糖，以連續(xù) 3次血糖≥16.8mmol/L，24h尿蛋白排泄≥3mg作為確定糖尿病腎病模型成功建立[4]的依據(jù)。模型建立后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠未出現(xiàn)死亡，即C組開始按200mg/kg·d體重灌胃給藥山楂葉總黃酮，A組和B組給予等量的生理鹽水，共用時(shí)12周。生化指標(biāo)測定:使用Olympus Au100全自動生化儀測定。放射免疫測定尿蛋白含量。免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自武漢博士德公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

(1)第4、8、12周各組大鼠體重、血糖測定，見表1。實(shí)驗(yàn)期間A組大鼠體重和血糖相對穩(wěn)定;B型組體重相對于A組明顯下降且出現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象，血糖相對于A組明顯增高(P＜0.05);C組體重相對于B組有明顯改善，且隨時(shí)間的延長有所增長(P＜0.05)。

表1 4周、8周和12周各組大鼠體重和血糖(±s，n=4)

表1 4周、8周和12周各組大鼠體重和血糖(±s，n=4)

*與對照組比較，P＜0.05;#與模型組比較，P＜0.05。

測量指標(biāo) 時(shí)間(周) A組 B組 C組體重(g) 4 284.50±18.57 173.50±7.19* 184.0±7.30*306.00±21.60 181.00±7.02* 205.25±8.77*#12 334.50±34.35 178.25±10.4* 226.50±8.54*#血糖(mmol/L) 4 6.03±0.56 27.08±1.32* 25.98±1.08*86.23±0.43 26.25±0.68* 20.38±1.17*#12 6.28±0.61 26.73±1.09* 16.60±1.46*#8

(2)第4、8、12周各組大鼠血尿素氮和肌酐含量測定，見表2。A組相對穩(wěn)定，B組和C組的第4周和第8周大鼠尿素氮和肌酐顯著高于A組(P＜0.01)，C組經(jīng)治療后尿素氮、肌酐含量在第4周開始下降，隨治療時(shí)間的延長而顯著下降，C組大鼠12周后尿素氮、肌酐含量與A組無太大差異(P ＞0.05)。

表2 4周、8周和12周各組大鼠尿素氮和肌酐含量(±s，n=4)

表2 4周、8周和12周各組大鼠尿素氮和肌酐含量(±s，n=4)

*與對照組比較，P＜0.05;#與模型組比較，P＜0.05。

測量指標(biāo) 時(shí)間(周) A組 B組 C組尿素氮 (mmol/L) 4 7.48±0.83 16.08±1.48* 13.18±1.39*#5.93±1.42 17.40±2.46* 10.20±1.53*#12 7.38±1.87 16.65±1.97* 9.58±2.53#肌酐(μmol/L) 4 60.4±2.59 95.18±3.41* 82.33±9.62*#860.63±1.36 98.13±8.24* 81.58±10.60*#12 60.80±2.15 117.65±12.29* 73.85±11.478#

(3)第4、8和12周時(shí)各組大鼠靜脈血中膽固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白含量，見表3。

A組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中血脂各項(xiàng)所測指標(biāo)均處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。在第4周和第8周時(shí)B組和C組大鼠靜脈血中膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白明顯高于 A組(P＜0.01)。治療12周后，C組大鼠靜脈血中膽固醇、甘油三酯含量顯著低于 B組，且與A組差異無顯著性(P＞0.05)。第4周和第8周時(shí)，B組和C組大鼠靜脈血中高密度脂蛋白含量顯著低于A組(P＜0.01)。C組經(jīng)過12周灌胃治療后，該組大鼠靜脈血中高密度脂蛋白含量顯著升高，相對于B組具顯著性差異(P＜0.01)，且與A組無差異。第4、8和12周，B組和C組大鼠靜脈血中低密度脂蛋白顯著高于A組(P＞0.05)，且C組大鼠靜脈血中低密度脂蛋白顯著低于B型組(P＜0.01)。

表3 4周、8周和12周各組大鼠血脂膽固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白含量(±s，n=4)

表3 4周、8周和12周各組大鼠血脂膽固醇、甘油三酯、高、低密度脂蛋白含量(±s，n=4)

*與對照組比較，P＜0.05;# 與模型組比較，P＜0.05。

血脂系列 時(shí)間(周) A組 B組 C組膽固醇(mmol/L) 4 1.24±0.22 2.01±0.24* 1.73±0.17*8 1.15±0.24 2.53±0.15* 1.55±0.07*#12 1.14±0.2 2.70±0.2* 1.37±0.14#甘油三酯(mmol/L) 4 0.84±0.4 2.35±0.29* 1.91±0.17*8 1.04±0.28 2.44±0.42* 1.25±0.18*#12 0.96±0.27 2.40±0.49* 1.18±0.21#高密度脂蛋白(mmol/L) 4 2.32±0.21 1.12±0.08* 1.17±0.15*8 2.53±0.14 1.15±0.2* 1.28±0.16*12 2.50±0.16 1.20±0.24* 2.20±0.25#低密度脂蛋白(mmol/L) 4 1.55±0.22 5.44±0.22* 4.11±0.33*#8 1.52±0.27 5.58±0.47* 3.33±0.21*#12 1.56±0.0 5.51±0.24* 2.32±0.55*#

(4)第4、8、12周各組大鼠24h尿蛋白測定，見表4。A組大鼠24h尿蛋白排泄率在實(shí)驗(yàn)期間無顯著變化。第4、8周B組和C組大鼠24h尿蛋白顯著高于A組(P＜0.01)，但C組經(jīng)灌胃給藥山楂葉總黃酮治療后，在第4和8周時(shí)尿蛋白呈下降趨勢，且含量顯著低于B組(P＜0.05)。第12周后，C組大鼠尿蛋白仍然高于A組，但相對于A組無顯著差異(P ＞0.05)。

表4 4周、8周和12周各組大鼠尿蛋白含量(±s，n=4)

表4 4周、8周和12周各組大鼠尿蛋白含量(±s，n=4)

*與對照組比較，P＜0.05;# 與模型組比較，P＜0.05。

檢測指標(biāo) 時(shí)間(周) A組 B組 C組尿蛋白(mg/24h) 4 0.68±0.32 5.20±0.67* 3.47±0.59*#8 0.83±0.23 6.79±1.31* 3.46±0.90*#12 0.68±0.23 7.36±2.05* 1.30±0.81#

3 討論

國內(nèi)外研究已經(jīng)證實(shí)[5]，LDL在AS發(fā)病過程中起到極為重要的作用，而其與腎小球硬化與系膜細(xì)胞增殖和增生的作用值得深入研究。系膜細(xì)胞表明有LDL受體，它可攝取LDL。LDL在腎小管和腎間質(zhì)沉積可造成腎小球和間質(zhì)的病理損害。還可進(jìn)一步被氧化修飾成氧化型LDL，后者可使受損的內(nèi)皮細(xì)胞釋放生長因子和細(xì)胞因子，如刺激VEGE、PDGE和TGF－β1等的表達(dá)與分泌，導(dǎo)致系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌增加。有研究顯示[6～8]在早期糖尿病中存在有脂代謝紊亂的現(xiàn)象，隨著病程的進(jìn)展，血脂紊亂愈加明顯。糖尿病腎病患者隨著微量蛋白尿的出現(xiàn)即有TG和LDL的升高。伴隨著腎臟損害加重，大量蛋白尿的排出，血脂紊亂進(jìn)一步加重，提示脂代謝紊亂與糖尿病腎病關(guān)系密切。

血管內(nèi)皮功能障礙在糖尿病腎病腎臟病變發(fā)生及發(fā)展中起著明顯作用，多種因子參與這個(gè)過程，其中血管內(nèi)皮生長因子的作用在糖尿病腎病微血管病變的發(fā)生過程中已被證實(shí)。研究表明[2]，糖尿病腎病患者腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂的發(fā)生與VEGF密不可分并受其介導(dǎo)。VEGF通過改變內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，增加腎小球毛細(xì)血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、腎臟肥大等基質(zhì)參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

山楂葉是一種中藥，具有味酸，性平，入肺經(jīng)等特點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)山楂葉化學(xué)成分的主要成分是黃酮類。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[3]FHL可明顯降低糖尿病小鼠血清中血糖、總膽固醇、甘油三酯水平，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，并可以改善糖尿病引起的腎臟組織脂肪積累。本研究表明山楂葉總黃酮能明顯降低患者體內(nèi)尿蛋白，血肌酐和尿素氮的含量，有效改善腎功能。并通過改善腎小管結(jié)構(gòu)，減少EMC積聚，有效延緩糖尿病腎病大鼠的腎臟組織病理學(xué)損傷。山楂葉總黃酮同時(shí)可以逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病引起的大鼠脂代謝紊亂，說明山楂葉總黃酮能調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，進(jìn)一步可以降低高血脂對腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，下調(diào)VEGF表達(dá)和分泌，從而改善系膜細(xì)胞增生并延緩腎小球硬化。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示山楂葉總黃酮治療后，C組臨床生化觀察指標(biāo)較模型組明顯改善，腎組織病理檢查也明顯減輕。免疫組化示VEGF表達(dá)與模型組相比下降，說明山楂葉總黃酮對糖尿病腎病大鼠的腎臟具有一定的保護(hù)作用，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相一致。糖尿病腎病大鼠早期應(yīng)用山楂葉總黃酮可降低糖尿病腎病大鼠的血脂從而能減輕尿蛋白排泄以及下調(diào)VEGF表達(dá)，阻礙基底膜增厚，提示山楂葉總黃酮是一個(gè)新的保護(hù)腎臟，延緩糖尿病腎病發(fā)展的方法與途徑。

[1]李佐強(qiáng)，舒昌達(dá)，邱鴻鑫.重慶地區(qū)471例糖尿病并發(fā)癥分析[J].四川醫(yī)學(xué)，1982，3(3):137-138

[2]趙東家.來氟米特對糖尿病腎病大鼠腎臟VEGF表達(dá)的研究[D].山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010

[3]楊宇杰.山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血管功能損傷的保護(hù)作用[J].中草藥，2007，38(11):1687

[4]張芳林，李果，劉優(yōu)萍，等.2型糖尿病大鼠模型的建立及其糖代謝特征分析[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2002，10(1):16-20

[5]Chou H H，Hsu L A，Peng C H，et al.Oxidative Stress is Associated with Urinary Albumin Excretion in Taiwanese Women[J].Acta Cardiologica Sinica，2011，27(3):166-173

[6]司鳳霞，楊殿生，王柏欣.黃連素對2型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2005，28(4):10-11

[7]劉中柱，謝立民，劉艷姝，等.厄貝沙坦對早期糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞nephrin及podocin表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，34(1):7-8

[8]宋明明，馬小茹.山楂葉總黃酮對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中muller細(xì)胞功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(3):97-98