丹參川穹嗪注射液治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的實驗研究

王建峰

(攀鋼集團總醫(yī)院，四川攀枝花617023)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種原因未明的，以對稱性地累及外周關(guān)節(jié)與持續(xù)性滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的慢病程、多系統(tǒng)性免疫病。多數(shù)患者可以發(fā)展為病程遷延的多關(guān)節(jié)炎，伴有關(guān)節(jié)功能障礙，甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)外的系統(tǒng)性表現(xiàn)。微小血管的損害和滑膜細胞量增多被認為是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎的早期病理變化。病情發(fā)展后，滑膜水腫，絨毛形成。晚期，生成一些免疫球蛋白的多克隆自身抗體。這其中亦包含了各種趨化因子，受體及介質(zhì)的相互影響及作用。丹參川芎嗪注射液是由丹參與鹽酸川芎組成的復(fù)方制劑。本復(fù)方制劑有擴張外周血管阻力，減低TXA2的水平，直接清除氧自由基，改善循環(huán)，減輕心臟負荷，降低血液黏滯度，改善微循環(huán)的作用。亦有減少內(nèi)皮素的分泌，抑制免疫反應(yīng)和免疫復(fù)合物的形成的作用。此次研究是應(yīng)用丹參川穹嗪來治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠，觀察記錄其療效，并測定其血清中IL－1β、IL－6、TGF－β表達水平。觀測丹參川穹嗪在膠原誘導(dǎo)性大鼠中的治療效果，為丹參川穹嗪在臨床的應(yīng)用提供一定的方向線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60只清潔級Wistar大鼠，雌性，體重165～200g。卡介苗凍干粉(北京生物制品研究所)，牛Ⅱ型膠原(美國Sigma公司)，丹參川穹嗪注射液(吉林四長制藥有限公司)，IL－1β、IL－6及TGF－β酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒(天津索羅門生物科技有限公司)。

1.2 方法

將牛Ⅱ型膠原蛋白與卡介苗及等體積量CFA充分乳化后，在隨機選取的45只大鼠背部與尾部皮下多點注射該乳化劑0.2mL，復(fù)制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen－induced arthritis，CIA)模型，為了保證成功，于第7、14再次給予加強注射乳化劑，剩余的15只作為對照組，給予同等劑量的生理鹽水注射。將造模成功的45只大鼠隨機分為3組，分別是膠原性關(guān)節(jié)炎模型組、丹參川穹嗪治療組與地塞米松治療組。然后，在造模后第15天選取15只通過腹腔注射丹參川穹嗪，按20mg/kg的劑量給藥，連續(xù)給藥兩周，此為丹參川穹嗪組。再次選取15只使用地塞米松磷酸鈉注射液，按0.2mg/kg劑量腹腔注射給予，同理連續(xù)給藥2周。剩余15只模型組與15只對照組給予等量的生理鹽水處理。實驗完畢后所有大鼠斷頭處死，每只取血約5mL，離心機4000r/min，低溫離心10min，取上清液，最后保存于－20℃冰箱中待測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS17.0，數(shù)據(jù)值采用均數(shù)±標準差(±s)來表示，兩組的比較采用t檢驗，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

模型大鼠血清中IL－1β、IL－6表達水平相較正常對照組有明顯升高(P＜0.05);治療組中丹參川穹嗪組較造模組有顯著降低(P＜0.05);其與地塞米松組無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

同樣的，模型組大鼠血清中TGF－β的水平較正常組是顯著下降(P＜0.05);治療組中丹參川穹嗪組比造模組有明顯升高(P＜0.05);其與地塞米松組無顯著差異(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比較(±s，n=15)

注:*與對照組比較，P＜0.05，#與造模組比較，P＜0.05。

組別 TGF－β IL－1βIL－6正常對照組0.91±0.07 13.78±1.52 22.49±1.77模型組 0.40±0.08* 46.39±3.31* 38.13±7.97*丹參川穹嗪組 0.63±0.11*# 27.42±5.63*# 29.23±6.22#地塞米松組 0.68±0.15*# 23.27±4.96*# 25.29±8.66#

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是表現(xiàn)為滑膜關(guān)節(jié)的慢性滲出性炎癥、增生為主要，進而侵蝕關(guān)節(jié)軟骨、骨膜、肌腱與韌帶等結(jié)締組織，終末期引起關(guān)節(jié)破壞畸形、關(guān)節(jié)功能的完全喪失的自身免疫性風(fēng)濕性疾病。發(fā)病年齡多來自于中老年女性，患病率大約為0.32%～0.36%。隨著醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)和生物學(xué)技術(shù)的飛快發(fā)展，對于RA的病因、病理機制研究有了一些新的認識和進步。目前大多認為本病是源于多種抗原生物因子介導(dǎo)和參與的免疫紊亂性疾病，可能和遺傳、各種感染、環(huán)境生態(tài)的污染破壞、藥物激素水平以及精神心理狀態(tài)等因素存在密切關(guān)系。長久以來，病毒感染因素一直被懷疑為引起RA的主要因素。隨著時間的推移，新的觀點不斷提出，有研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的的免疫細胞的數(shù)量與功能方面都出現(xiàn)了較顯著地失衡表現(xiàn)。RA的發(fā)病患者中Th1/Th2細胞發(fā)生失衡，Th1及Th1因子占有明顯優(yōu)勢，處在Th1型狀態(tài)中，通過分泌的大量細胞因子如IL－1β、TNF－α、IL－6、IFN －γ 等加重了炎癥反應(yīng)和損傷;另外在RA患者血清和關(guān)節(jié)液中觀察到TGF－β增高，TGF－β對T細胞活化和增殖、B細胞分化具有特異的抑制作用。丹參川穹嗪注射液作為一種祖國醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥方面的復(fù)方制劑，其方是通過科學(xué)合理的方法把鹽酸川穹嗪加丹參素配比提取的注射液。川穹嗪有活血化瘀的作用，其有效成分四甲基吡嗪鹽酸鹽可以保護血管內(nèi)皮，具有調(diào)節(jié)免疫、收縮血管、平衡纖溶和凝血機制，抗血小板活性聚集等作用。丹參素有抑制黏附分子，改善微循環(huán)，抑制NO產(chǎn)生等功能。

轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor－β，TGF－β)該家族中眾多蛋白成員都被證明在許多疾病的生理、病理機制中承擔了重要的功能。在免疫系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)上，TGF－β發(fā)揮了很重要的作用。近來對動物的免疫實驗研究表明，TGF－β直接或間接地的調(diào)控了所有參與免疫系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)細胞，幾乎所有白細胞的增殖、分化一系列生理和病理活動。TGF－β為炎癥免疫反應(yīng)的負方向調(diào)控因子，在血漿中生成后侵入幾乎所有組織器官，但主要浸潤到關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)，并和基質(zhì)結(jié)合到一起，來進一步發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。IL－l主要是由多種細胞產(chǎn)生，比如:星狀細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞及T、B細胞等。此外幾乎所有的有核細胞，均可產(chǎn)生IL－1。IL－1的家族至少有3個成員，即2個炎癥性激動劑IL－1α、IL－1β與l個抑制前兩者的受體性拮抗劑IL－1Ra。在人類IL－1β是起主要作用的，IL－1β主要由細胞釋放出來，它能分泌到細胞膜的外面，主要是通過作用于其它細胞而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。IL－1誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的機制有:(1)對基因表達的影響有，IL－1對不同的基因表達行使其起始轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定mRNA的功能，是IL－1具有不同生物學(xué)特性的基礎(chǔ)。(2)對受體表達的影響有，IL－1可以與靶細胞上的特異性受體結(jié)合后，才能充分發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，經(jīng)過細胞內(nèi)部的信息傳遞，來抑制一些基因的表達。(3)協(xié)同作用有，IL－1與緩激肽等其它細胞因子以及生長因子都有協(xié)同作用。IL－6亦有廣泛的生物學(xué)活性，尤其是在機體免疫反應(yīng)中具有重要的作用。IL－6可以具有強有力的誘導(dǎo)多克隆性B細胞分泌Ig M、Ig G與Ig A，也是T細胞產(chǎn)生細胞因子受體的化學(xué)誘導(dǎo)劑。L－6由于對T淋巴細胞兼有有趨化和活化兩方面的作用，因而在關(guān)節(jié)液中，IL－6可能促進 T細胞向炎癥性關(guān)節(jié)腔聚集并促使其活化。IL－6還可以對中性粒細胞與單核巨噬細胞的活性具有調(diào)控作用，并能刺激TNF－α、IL－1β、IL－15、IL－8、MCP－1和 IL－17等細胞因子的生成，大大加強了血管內(nèi)皮與白細胞之間的黏附作用，這些都有助于淋巴細胞聚集于炎癥局部周圍，擴大炎癥反應(yīng)過程。L－6還能促使B淋巴細胞增殖，促進 NK細胞分泌細胞因子與增加粘附分子的分布的轉(zhuǎn)變，最終影響T淋巴細胞對組織的浸潤、遷移。

本研究膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL－1β、IL－6表達水平在造模組中有明顯升高，揭示二者在大鼠關(guān)節(jié)炎形成中扮演積極重要的角色，而TGF－β在模型組表現(xiàn)為降低，表明其有限制淋巴細胞因子活性，阻礙細胞因子的產(chǎn)生作用。治療兩周后，血清中IL－1β、IL－6水平有明顯下降，相應(yīng)的TGF－β因子水平顯著升高。這些都說明丹參川穹嗪注射液明顯的調(diào)節(jié)免疫平衡，抑制炎癥產(chǎn)生的作用。也表明了其對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠有明顯的積極治療作用，也為此復(fù)方制劑在臨床中的合理運用提供一定的參考價值意義。另外，其具體的機制作用，尚不能完全明了。有待進一步深入研究。

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