鴨疫里氏桿菌吉林分離株16S rRNA系統(tǒng)分析及其OmpA基因克隆

高云航，劉佳麗，王 巍，徐鳳宇，張福君，馬紅霞*

(1．吉林農業(yè)大學動物科技學院，長春 130118;2．吉林正方農牧股份有限公司，吉林梅河 135000)

鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一種能夠引起家鴨、鵝、火雞等禽類高發(fā)病率和高死亡率的傳染性疾病［1－2］。該病雛鴨較為敏感，對養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重經濟損失［3－4］。OmpA蛋白族是革蘭氏陰性菌外膜中的主要成分，其主要作用是維持外膜的完整。缺少OmpA和胞壁脂蛋白的細菌變異株其形態(tài)為球形，細胞膜也不穩(wěn)定［5］。眾多試驗研究證明，提純的外膜蛋白和表達的外膜蛋白具有良好的抗原性［6］，能刺激機體產生細胞免疫和體液免疫。OmpA是各血清型RA所共有的外膜蛋白，具有種內相對保守性，但在不同的血清型之間存在著差異。曾有研究認為這種差異不足以影響蛋白質的抗原特性，因此可以作為保護多種血清型RA的亞單位疫苗的候選［7］。而16S rRNA在原核生物的細胞中普遍存在［8］，其在常見細菌的鑒別中發(fā)揮著不可忽視的作用。另外，16S rRNA在鑒別難于區(qū)分的細菌、生長速度緩慢的分支桿菌及微環(huán)境中廣泛存在的細菌等方面均具有十分重要的意義［9］。

因此，本文對從吉林省某鴨場分離出的兩株RA，對其16S rRNA基因的序列進行系統(tǒng)進化分析，設計特異性引物PCR擴增出兩株菌各自OmpA基因進行了序列測定與分析，以尋求RA 16S rRNA變異與OmpA基因之間的關系，為進一步研究RA的變異及其亞單位疫苗提供一定參考依據。

1 材料

1．1 菌種 RA吉林分離株 JL－RA1、JL－RA3，本實驗室分離并保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，北京全式金生物公司。

1．2 主要分子生物學試劑 EB、Amp，北京鼎國生物工程公司;ExTaq DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合 酶、T4 DNA Ligase、DNA Marker、dNTP、pMD－18T Simple Vector、限制性內切酶，日本TaKaRa公司;質粒小提試劑盒，天根生物公司;膠回收試劑盒，杭州維特潔生化技術有限公司。

1．3 引物設計 RA 16S rRNA基因序列的擴增采用細菌16S通用引物［10］:

TY －P1:5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3’;

TY－P2:5’－AAGGAGGTGATCCAGCC－3’。

根據已發(fā)表的不同血清型RA的OmpA全基因組序列(JQ083167、JN871507、JN871505 等)利用DNAStar軟件進行對比分析，并根據其保守區(qū)域設計特異性引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成:

OmpA－P3:5’－GCGATGGRYAARGAATTTATG－3’;

OmpA－P4:5’－GCGTTATTTTCTTTTCTTTTTTAC－3’。

2 方法

2．1 RA基因組總 DNA提取 用堿裂解法［11］提取分離株JL－RA1、JL－RA3基因組總DNA。

2．2 分離株16S rRNA序列擴增與測定

2．2．1 分離株16S rRNA序列擴增 PCR反應體系:模板總 DNA 0．5 μL，TY － P1 0．5 μL，TY － P2 0．5 μL，2．5 mmol/L dNTPs Mixture 2．0 μL，10 ×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2．5 μL，Ex Taq(5 U/μL)0．3 μL，ddH2O 18．7 μL，總體積 25 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃再延伸10min。

2．2．2 分離株16S rRNA序列測定與分析 將兩株菌16S rRNA PCR產物均送往上海生工生物科技公司進行雙向測序。測序結果利用NCBI BLAST軟件于GenBank中同源性較高的菌株序列進行比對分析，選取RA各血清型代表菌株及高同源性菌株，并用DNAStar中Meg Align軟件分析構建系統(tǒng)進化樹，確定該菌株的分類學地位。

2．3 分離株OmpA序列擴增與測定

2．3．1 分離株OmpA序列擴增 PCR反應體系:模板總 DNA 0．5 μL，OmpA － P3 0．5 μL，OmpA － P4 0．5 μL，2．5 mmol/L dNTPs Mixture 2．0 μL，10 ×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2．5 μL，Ex Taq(5U/μL)0．3 μL，ddH2O 18．7 μL，總體積25 μL。PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán);72℃再延伸10min。2．3．2 分離株OmpA序列測定與分析 將兩株菌OmpA PCR產物均送往上海生工生物科技公司測序。測序結果利用NCBI BLAST軟件于GenBank中同源性較高的菌株序列進行比對分析，并用DNAStar中MegAlign軟件分析構建系統(tǒng)進化樹，確定該菌株的分類學地位。

3 結果

3．1 分離株總DNA的提取結果 由圖1電泳結果可知，兩株分離株JL－RA1、JL－RA3總DNA，其核苷酸片段大小約為23000 bp，與預期結果相符。

圖1 RA總DNA電泳結果

3．2 分離株16S rRNA序列擴增結果與分析

3．2．1 分離株16S rRNA序列擴增結果 兩株分離株JL－RA1和JL－RA3 16S rRNA序列擴增結果見圖2，得到約為1478 bp的核苷酸片段，其片段大小與預期結果相符。

3．2．2 分離株16S rRNA序列測定結果與同源性分析 JL－RA1、JL－RA3 16S rRNA PCR擴增產物的測得序列大小均為1478bp，并將測序結果登陸到GenBank中，獲得登錄號分別為 HQ392516和HQ707076(登錄系列為已去掉引物部分)。JL－RA1、JL－RA3 16S與GenBank中已知的RA16S rRNA序列相似性較高(圖3)。鴨疫里默氏桿菌分離株系統(tǒng)進化分析結果如圖4所示。

圖2 16S rRNA PCR擴增結果

圖3 分離株JL-RA1、JL-RA3 16S rRNA矩形圖

圖4 分離株JL-RA1、JL-RA3 16S rRNA系統(tǒng)進化樹

3．3 分離株OmpA PCR序列擴增結果與分析

3．3．1 分離株 OmpA序列擴增結果 JL－RA1、JL－RA3 OmpA基因PCR擴增結果顯示，僅有一條目的條帶，大小約為1182 bp，PCR擴增產物大小與預計目的片段大小相符，見圖5。

3．3．2 分離株JL－RA1 OmpA序列測定及同源性分析 將JL－RA1、JL－RA3 OmpA基因PCR產物測得序列大小為1182 bp，并將測序結果登陸到GenBank中，獲得登錄號分別為 HQ707077和HQ707078。

圖5 JL-RA1 Om pA、JL-RA3 Om pA擴增結果

JL－RA1和JL－RA3 OmpA測得長度為1164個核苷酸的序列組成的ORF，編碼387個氨基酸組成的蛋白質，起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA，其核苷酸序列非常保守。利用BLAST軟件與GenBank中已知的鴨疫里默氏桿菌OmpA序列進行同源性對比，JL－RA1、JL－RA3與已報道的鴨疫里默氏桿菌株OmpA基因序列相似性較高(圖6)。鴨疫里默氏桿菌分離株OmpA系統(tǒng)進化分析表明結果如圖7所示。

4 討論

圖6 分離株JL-RA1 Om pA矩形圖

圖7 分離株JL-RA1 OmpA系統(tǒng)進化樹

細菌的16S rRNA基因分子結構是保守區(qū)和特異性區(qū)域交替出現，因此針對保守區(qū)設計細菌通用引物，將所得的序列與GenBank中已知序列比對，此方法常用于對細菌的種屬鑒定［12］，比常規(guī)細菌生化鑒定更準確快速。李永峰等［13］根據Matsuki的研究，認為16S rRNA序列的同源性大于97%便可認為是同一種細菌。本試驗分離株JL－RA1、JL－RA3與 RA標準株 ATCC11845(登錄號U60101)序列同源性高達99．6%和99．5%，進一步說明兩株分離株均為RA。這種方法可以更加快捷準確的確定細菌的種屬及其分類地位。程龍飛等［14］對29株1型和2型 RA 16S rRNA 和16S－23S rRNA間隔區(qū)的核苷酸序列，親緣關系比較以及針對各菌滅活苗進行交叉攻菌保護試驗，證明2型RA菌株中的RA f11并不處在2型菌株的分支中，與1型菌株非常接近，其對1型菌株的攻擊可產生較高的交叉保護率達53．8%。本試驗分離株屬于RA 1型，但與RA 2型較1型更近，推測分離株JL－RA1和JL－RA3是否具有1型和2型的交叉保護力，將對此進行進一步驗證。

OmpA是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分，具有免疫原性和相對保守性，不僅可激發(fā)機體產生體液免疫，而且還可引起細胞免疫，常被用于試劑疫苗的研究，如多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等的外膜蛋白，展現出良好的應用前景［15－16］。目前，已有不少學者對RA的表面免疫蛋白進行了研究，并認為OmpA基因是所有血清型的RA所共有的結構基因，盡管其機理尚未完全清楚，但周祖濤［17］等用PCR方法擴增了血清1型RA－YM株的主要外膜蛋白OmpA基因，并構建了原核表達載體pKG－OmpA，在大腸桿菌中進行了高效表達，融合蛋白大小約為68 kD，Western－blot結果表明該表達蛋白具有良好的免疫原性。本研究成功的擴增了 JL－RA1和 JL－RA3的 OmpA基因，與GenBank中已報道的RA OmpA(1型)的序列同源性較高。從JL－RA1 16S和OmpA系統(tǒng)進化分析可以看出，該分離株16S和OmpA均與血清型1型親緣關系較近，與本試驗結果一致。

本試驗兩株分離株JL－RA1、JL－RA3分離自同一發(fā)病養(yǎng)鴨場，JL－RA1為該鴨場初次發(fā)病時分離得到，病情得以控制后，再次發(fā)病時分離得到JL－RA3，與RA易反復爆發(fā)形成地方性疾病這一特征相符［18］。兩株菌從16S rRNA基因和 OmpA基因同源性均為99．8%，由此可以看出，RA的16S rRNA基因和OmpA保護性基因有微小變異，但其毒力基因是否發(fā)生變異，需進行進一步驗證。

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