兒童口服液對(duì)小鼠免疫功能的影響

黃生權(quán)，甘海寧，賴煥玲

兒童口服液由枸杞子、茯苓、香菇、山楂、金針菇、紅棗等10余種藥食同源的中草藥配伍，針對(duì)少年兒童生長(zhǎng)發(fā)育過程中的生理特點(diǎn)，運(yùn)用現(xiàn)代高新技術(shù)精制而成，富含多種氨基酸、維生素及微量元素可提升兒童抵抗力，均衡兒童所需營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)兒童體質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)觀察了兒童口服液對(duì)小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 受試藥物

兒童口服液，由無限極（中國(guó)）有限公司提供，批號(hào)：12J16A01A-A；茯苓多糖口服液，湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20120602。

1.2 主要試劑、儀器

環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04120704；DNCB，廣州齊云生物科技有限公司，批號(hào)：0168B383；丙酮，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20110414；蓖麻油，天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，20100205；RPMI1640培養(yǎng)液，Thermo，批號(hào)：NXJ0699；小牛血清，GIBCO，批號(hào)：8122818；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，EL204；恒溫水浴箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DK-420S；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientif i c Oy，1510。

1.3 動(dòng)物

KM小鼠，SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0020，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 對(duì)免疫器官重量的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組和模型組給予等容積蒸餾水。于實(shí)驗(yàn)前5 d，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。末次給予受試樣品1 h后，脫頸椎處死小鼠，取胸腺和脾臟精密稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2 溶血素抗體含量測(cè)定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前5 d，除正常空白對(duì)照組外均腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。試驗(yàn)第24 d，各組腹腔注射綿羊紅細(xì)胞（0.2 mL/只），免疫6 d后，眼眶取血，分離血清進(jìn)行溶血素含量的測(cè)定。

綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的制備：兩倍體積液阿氏液（Alsever）與一倍體積綿羊紅細(xì)胞混勻，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)取上述保存的綿羊紅細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次，每次2000 rpm，5 min，棄上清液，再用生理鹽水3:5稀釋。

補(bǔ)體制備：取豚鼠8只，心臟采血，離心分離血清，-20℃保存，臨用時(shí)生理鹽水1:10稀釋。

溶血素測(cè)定：取小鼠血清，用生理鹽水500倍稀釋。各組樣品管中分別加入1:500小鼠血清1 mL、1:10補(bǔ)體血清1 mL、以及稀釋10%SRBC 0.5 mL混勻，另取空白管，分別加入等量的補(bǔ)體、SRBC及1 mL生理鹽水。然后各管于37℃水浴鍋中水浴10 min后，冰浴10 min終止反應(yīng)，2000 rpm離心10 min，取上清液，以空白管調(diào)零，在可見光分光光度計(jì)540 nm處測(cè)定各管OD值。記錄結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.3 對(duì)遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等容積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前5 d，每只小鼠腹部去毛，范圍約3 cm×3 cm，將含5%DNCB的丙酮麻油溶液(1:1,V/V)50 μL均勻涂抹致敏，次日強(qiáng)化1次；小鼠致敏后立即腹腔注射環(huán)磷酰胺125 mg.kg-1誘導(dǎo)小鼠降低的DTH反應(yīng)。致敏5 d后，用5%DNCB丙酮麻油溶液10 μL均勻涂抹于各組小鼠右耳內(nèi)外兩面進(jìn)行攻擊，左耳涂抹等量無DNCB的丙酮麻油溶液。攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，于耳片外側(cè)2/3部分用打孔器取下直徑8 mm的耳片，置電子天平稱重，以左右耳片重量之差作為腫脹度。記錄結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2.4 對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前5 d，除正常對(duì)照組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。末次給予受試樣品1 h后，由小鼠尾靜脈注入50%印度墨汁生理鹽水溶液（0.1 mL/10g），在注入墨汁后30 s及6 min從小鼠眼眶取血，用移液槍取25 μL，立刻吹入2 mL Na2CO3（0.1%）溶液中，于該溶液中吸入、吹出數(shù)次以充分洗出吸管壁附著之血液。再取25 μL空白小鼠血置于2 mL0.1% Na2CO3溶液中作為校準(zhǔn)，于可見分光光度計(jì)675 nm處測(cè)定吸光度。脫頸椎處死小鼠，取肝臟和脾臟精密稱重，按下式計(jì)算吞噬指數(shù)K、吞噬系數(shù)（校正吞噬指數(shù)）α。記錄結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

（式中C為血中碳粒濃度即吸光度；T為時(shí)間（min）；W為體重（g）；WLS為肝脾合重（g））

2.5 NK細(xì)胞活性測(cè)定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對(duì)照組給予等容積蒸餾水。末次給予受試樣品1 h后處死動(dòng)物，取脾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。①小鼠脾細(xì)胞懸液的制備方法同前，細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。②靶細(xì)胞：傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前一天換液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化1～2 min，加完全1640培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞使其完全從壁上脫落，1000 rpm離心5 min，傾去上清液，將沉積細(xì)胞重懸于含10%小牛血清1640培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL即為備用的靶細(xì)胞。③NK細(xì)胞活性的測(cè)定：向96孔平底塑料培養(yǎng)板每孔中分別加入靶細(xì)胞懸液（0.1 ml/孔）,然后放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，使靶細(xì)胞貼壁成一單層細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每孔加入0.1 mL效應(yīng)細(xì)胞(使效靶細(xì)胞比例為50:1)，每樣品做3個(gè)復(fù)孔，靶細(xì)胞對(duì)照孔加1640培養(yǎng)液0.1 mL，再放置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，傾去上清液，用生理鹽水輕輕灌滿各孔，以除去效應(yīng)細(xì)胞及被殺傷而脫落下來的靶細(xì)胞，重復(fù)3次，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分，每孔加入0.1 mL中性紅染液（0.1%），37℃培養(yǎng)30 min，棄去染液，再用生理鹽水洗3次后，每孔加入0.1 mL細(xì)胞溶解液（醋酸：乙醇=1:1)，使吞有中性紅的靶細(xì)胞溶解，釋放出中性紅，輕輕震蕩使分散搖勻。用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定OD值。按照如下公式計(jì)算殺傷率即為NK細(xì)胞活性。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2. 6 統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±S表示。計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及組間檢驗(yàn)。P < 0. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兒童口服液對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

表1 兒童口服液對(duì)免疫器官重量的影響（x±S）

3.2 兒童口服液對(duì)小鼠血清溶血素含量的影響

表2 兒童口服液對(duì)溶血素抗體含量的影響（x±S）

3.3 兒童口服液對(duì)小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)的影響

表3 兒童口服液對(duì)環(huán)磷酰胺降低小鼠DTH反應(yīng)的影響（x±S）

3.4 兒童口服液對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

表4 兒童口服液對(duì)單核-巨噬細(xì)胞功能的影響（x±S）

3.5 兒童口服液對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表5 受試品對(duì)NK細(xì)胞活性的影響（x±S）

4 討論

胸腺和脾臟都是重要的免疫器官，其中胸腺是T細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，其功能狀態(tài)直接決定機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，并間接影響體液免疫功能。脾臟是免疫細(xì)胞定居的場(chǎng)所，也是免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，可以制造免疫球蛋白、補(bǔ)體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用[1]。體液免疫是機(jī)體特異性免疫的重要組成部分，負(fù)責(zé)體液免疫的細(xì)胞是B細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞在抗原刺激及Th細(xì)胞輔助下，最終分化成能產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞?？贵w形成細(xì)胞數(shù)量的多少可反映機(jī)體體液免疫的水平[2]。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由于機(jī)體T2淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，分化為特異性的致敏T2淋巴細(xì)胞，當(dāng)致敏T2淋巴細(xì)胞再次接觸相同的抗原后，引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)，使T2淋巴細(xì)胞活化，釋放出多種淋巴因子，產(chǎn)生炎癥，炎癥反應(yīng)的程度反映了機(jī)體對(duì)該抗原特異性細(xì)胞免疫力的大小[3]。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在機(jī)體的特異性和非特異性免疫中亦發(fā)揮重要作用，如直接吞噬、殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子等，顯示出非特異性免疫作用[4]。NK細(xì)胞是一類重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的組成部分，NK細(xì)胞能非特異性地殺傷靶細(xì)胞（主要是某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞），因此，NK細(xì)胞在腫瘤免疫、抗病毒感染中具有重要作用，已公認(rèn)其在免疫監(jiān)視中為最重要的效應(yīng)細(xì)胞[5]。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，兒童口服液可顯著升高免疫功能低下小鼠的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù), 增加血清中溶血素抗體的含量，提高免疫抑制小鼠遲發(fā)超敏反應(yīng)強(qiáng)度，增加單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高小鼠NK細(xì)胞的活性，提示兒童口服液能夠提高機(jī)體免疫功能。

[1] 沈關(guān)心.微生物與免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:17.

[2] 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第二版)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:159.

[3] 徐叔云.藥理試驗(yàn)方法學(xué)(第三版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1420.

[4] 劉藝萍.巨噬細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)?免疫學(xué)分冊(cè),1998, 21(4): 207.

[5] 王蒙.自然殺傷細(xì)胞的抗病毒活性[J].免疫學(xué)雜志, 2003,19(2):154.