脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶活性水平及其I198T基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究

岳志紅，賈 玫，李珊珊

（北京大學(xué)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京100044）

2型糖尿病在中國(guó)是一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，最近報(bào)道在我國(guó)糖尿病的發(fā)病率已經(jīng)增加到9．7%，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了預(yù)計(jì)2025年中國(guó)糖尿病發(fā)病率將增加到8%［1］的推論。糖尿病慢性血管并發(fā)癥是患者死亡及致殘的首要原因，糖尿病加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展是引起血管并發(fā)癥的重要機(jī)制。脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2（lipoprotein－associated phospholipase A2，Lp－PLA2）是新近發(fā)展的炎癥反應(yīng)因子，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［2－4］，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用［5］。但是，目前，對(duì)Lp－PLA2酶活性及其基因多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)收集了117例2型糖尿病患者和203例健康對(duì)照者，探討Lp－PLA2的酶活性水平及其I198T點(diǎn)突變與2型糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的遺傳機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1．1 對(duì)象

1．1．1 2型糖尿病組：收集2009年10月至2010年5月，北京大學(xué)人民醫(yī)院糖尿病住院患者117例，均符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）診斷標(biāo)準(zhǔn)，且排除：（1）1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及近期發(fā)生過(guò)糖尿病并發(fā)癥患者；（2）嚴(yán)重肝、腎功能不全患者；（3）心力衰竭及風(fēng)濕瓣膜性心臟病患者；（4）感染性疾病及腫瘤患者；（5）免疫性及血液性疾病患者。根據(jù)是否服用降脂藥分為兩組：T2DM1為服用降脂藥組；T2DM2為未服用降脂藥組。

1．2．2 健康對(duì)照組：收集2011年3月至2011年5月，北京某單位職工體檢者203名，均無(wú)2型糖尿病病史，且均無(wú)內(nèi)科系統(tǒng)器質(zhì)性病變。

1．2 方法

1．2．1 血液生化指標(biāo)的測(cè)定 超敏C反應(yīng)蛋白（High sensitivity C－reactive protein，Hs－CRP）、脂蛋白a（lipoprotein a，Lp（a））、膽固醇（Cholesterol，CHO）、甘油三酯 （Triglyceride，TG）、空腹血糖（Glucose，GLU）、高密度脂蛋白膽固醇（High－density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（Low－density lipoprotein cholesterol，LDL）測(cè)定使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀；試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品均由日本和光公司提供。

1．2．2 血清Lp－PLA2活性水平的檢測(cè) 采用美國(guó)Cayman公司提供的PAF－AH活性測(cè)定試劑盒，使用BioTek Elx808全自動(dòng)酶標(biāo)儀，測(cè)定血漿中Lp－PLA2活性水平。

1．2．3 人全血標(biāo)本基因組DNA的提取 采用日本東洋紡（TOYOBO）磁珠法（編號(hào) NPK－101）DNA提取試劑盒，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝新鮮全血標(biāo)本，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行操作，提取基因組DNA標(biāo)本－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4 引物及TaqMan探針設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)采用Primer 5．0軟件，由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成，北京賽百盛生物技術(shù)公司合成TaqMan探針（5’– TGCAGCAGATTGGTCCTTGAAATAGTA－3’）。I198T點(diǎn)突變擴(kuò)增片段長(zhǎng)度164bp，野生和突變上游引物3’端－2位引入錯(cuò)配堿基“G”（正配堿基應(yīng)為“T”）（野生引物5’– GAGCCAAGACTTGTCCCCGA－3’；突 變 引 物 5’－GAGCCAAGACTTGTCCCCGG－3’）。TaqMan探針與上游引物擴(kuò)增的模板鏈互補(bǔ)。TaqMan探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)TAMRA。

1．2．5 TaqMan－ARMS方法反應(yīng)體系及測(cè)定條件：使用BIO－RAD Opticon 2熒光定量PCR儀檢測(cè)TaqMan探針FAM熒光信號(hào)。反應(yīng)體系：人基因組 DNA（2．8μg／ml）2μl，2．5×realMasterMix，8 μl，上、下游引物各0．25μmol／L，探針0．25μmol／L，20×Probe Enhancer solution 1μl，ddH2O 6μl。反應(yīng)條件94℃2min，94℃20sec，56℃35sec，45個(gè)循環(huán)。

1．2．6 基因型判斷標(biāo)準(zhǔn) 野生型為Δct＞7．13±0．55或 M引物無(wú)擴(kuò)增曲線；雜合突變型為－0．21＜Δct＜0．71－7．98；純合突變型為 Δct＜－7．98±3．97或W引物無(wú)擴(kuò)增曲線。當(dāng)W、M引物均有擴(kuò)增曲線，且Δct值在－4．01＜Δct＜－0．21或0．71＜Δct＜6．58范圍時(shí)復(fù)查或測(cè)序。隨機(jī)抽取40份標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，與TaqMan－ARMS檢測(cè)I198T點(diǎn)突變的結(jié)果一致，符合率為100%（注：M引物：突變引物；W引物：野生引物）。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用HWE軟件分析兩組的Hardy－Weinberg平衡；采用SPSS16．0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用ˉx±s表示，不符合正態(tài)分布者選用中位數(shù)（25%，75%）表示，并轉(zhuǎn)化為以10為底的對(duì)數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)2型糖尿病組和健康對(duì)照組的基本特征與Lp－PLA2的酶活性水平進(jìn)行分析；應(yīng)用方差分析對(duì)不同基因型的酶活性水平進(jìn)行分析；應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對(duì)基因頻率進(jìn)行分析：應(yīng)用logistic回歸分析對(duì)Lp－PLA2的酶活性水平與2型糖尿病相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 研究對(duì)象的基本特征

由表1可見(jiàn)，T2DM2組、T2DM1組和對(duì)照組的平均年齡分別是（69．70±9．48）（67．94±10．87）歲和（68．77±11．65）歲，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T2DM2組和T2DM1組糖尿病患者均進(jìn)行嚴(yán)格血糖控制，GLU間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T2DM2組和T2DM1組HDL－C較對(duì)照組低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）。Hs－CRP、Lp（a）高于對(duì)照組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．005）。但是，TG在3組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但T2DM2組和T2DM1組CHO和LDL－C較對(duì)照組低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）。糖尿病患者為了防止并發(fā)癥，采取嚴(yán)格降脂治療。而健康對(duì)照組為老年人，且未服用降脂藥，故T2DM組的CHO及LDL值會(huì)低于健康對(duì)照組。?

表1 研究對(duì)象的基本特征（ˉx±s）

2．2 Lp－PLA2的酶活性水平與2型糖尿病的相關(guān)性

隨機(jī)選擇部分標(biāo)本測(cè)量Lp－PLA2的酶活性水平。Lp－PLA2的酶活性水平在T2DM2（未服用降脂藥n＝39）、T2DM1（服用降脂藥n＝26）和Control（n＝116）組成依次遞減趨勢(shì)［29．44（16．10，55．81），21．39（12．42，52．82），19．77（14．63，26．61）nmol·ml－1·min－1］，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖1。

進(jìn)一步按照Lp－PLA2的酶活性水平根據(jù)3個(gè)四分位數(shù)將研究對(duì)象分為不同水平組Q1－Q4，評(píng)估具有不同Lp－PLA2酶活性水平2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)。表2給出了較高的三個(gè)組與最低組相比2型糖尿病OR值及95%CI。校正年齡和性別后，與最低組（Lp－PLA2＜14．79nmol·ml－1·min－1）相比，最高組（Lp－PLA2＞34．17nmol·ml－1·min－1）2型糖尿病的 OR是5．05（95%CI，1．88～13．60）（模型1）。進(jìn)一步校正傳統(tǒng)冠心病危險(xiǎn)因素包括CHO、TG、Hs－CRP、Lp（a）后，關(guān)聯(lián)更加顯著（OR ＝12．21，95%CI，2．88～51．80）（模型2）。在模型2基礎(chǔ)上進(jìn)一步校正LDL和HDL（模型3），關(guān)聯(lián)依然顯著（OR ＝9．49，95%CI，2．02～44．63）。

圖1 Lp－PLA2的T2DM與健康對(duì)照組的酶活性水平

表2 Lp－PLA2酶活性水平與2型糖尿病的相關(guān)性

2．3 基因多態(tài)性

2．3．1 I198T基因型及等位基因頻率比較 2型糖尿病組和健康對(duì)照組所有多態(tài)符合Hardy－Weinberg平衡。I198T點(diǎn)突變有3種基因型II型、IT型、TT型（表3）。與健康對(duì)照組比較，2型糖尿病組的II基因型頻率與健康對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0．05），IT基因型頻率高于健康對(duì)照組（P＜0．05），TT基因型頻率低于健康對(duì)照組（P＜0．05）；組間等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 T2DM組和對(duì)照組I198T基因型及等位基因頻率比較（%）

2．3．2 基因型分組Lp－PLA2酶活性水平的比較由表4可知，與基因型IT相比，基因型II的Lp－PLA2酶活性最高［22．79（15．49，36．11）nmol·ml－1·min－1，P＜0．05］。基因型 TT 的 Lp－PLA2酶活性最低［15．70（8．83，22．60）nmol·ml－1·min－1，P＜0．05］（圖2）。

表4 I198T點(diǎn)突變不同基因型的Lp－PLA2酶活性水平

2．3．3 I198T基因型與2型糖尿病相關(guān)性 見(jiàn)表5，以T2DM（是，否）為因變量，基因型（II，或IT和TT）為自變量，Binary logistic回歸分析顯示，與基因型II相比，基因型TT與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)不顯著（P＞0．05），基因型IT與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)顯著（OR：2．13CI：（1．11－4．07）P＜0．05）。

表5 I198T點(diǎn)突變不同基因型的發(fā)生2型糖尿病的危險(xiǎn)性及其95%可信區(qū)間

圖2 Lp－PLA2在I198T不同基因型的酶活性水平

3 討論

3．1 Lp－PLA2酶活性水平與2型糖尿病相關(guān)性

Lp－PLA2又稱為血小板活化因子乙酰水解酶（PAF－AH），是由441個(gè)氨基酸殘基組成的一種絲氨酸酯酶，屬于磷脂酶家族，分子量50kDa。人血清中Lp－PLA2主要由成熟的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，并受炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，而血小板活化因子（PAF）促進(jìn)其分泌。在血漿中，約85%Lp－PLA2與LDL結(jié)合，尤其是與小而密的負(fù)電性LDL結(jié)合，其余與HDL或極低密度脂蛋白（VLDL）結(jié)合［6］。最近，國(guó)外幾個(gè)較大的流行病學(xué)和臨床前瞻性研究認(rèn)為，血清Lp－PLA2是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，參與炎癥反應(yīng)，與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)Lp－PLA2的酶活性水平在2型糖尿病患者中顯著升高，logistic回歸在校正了各項(xiàng)混雜因素包括年齡、性別、CHO、TG，、Hs－CRP、Lp（a）后，Lp－PLA2酶活性的最高組與最低組相比，2型糖尿病的OR值為12．21（2．88－51．80）。以上結(jié)果表明，2型糖尿病病人具有較高的Lp－PLA2酶活性，Lp－PLA2可作為糖尿病獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重影響臨床最終事件的發(fā)生。這與來(lái)自美國(guó)的一項(xiàng)研究結(jié)果一致［7］。另一項(xiàng)研究結(jié)果也證實(shí)，Lp－PLA2的濃度與2型糖尿病并不相關(guān)，但是其酶活性水平在2型糖尿病患者中卻顯著升高［8］。

國(guó)內(nèi)研究表明［9］，羅格列酮能明顯減輕糖尿病大鼠血管病變程度，降低血管局部及外周血Lp－PLA2表達(dá)。最新國(guó)外研究表明［10］，2型糖尿病患者通過(guò)強(qiáng)化血糖控制治療，能夠起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，包括小顆粒LDL減少，結(jié)合于HDL的Lp－PLA2的比例增多。這些研究均提示Lp－PLA2水平有可能作為2型糖尿病的治療目標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，服用降脂藥的T2DM1比未服用降脂藥的T2DM2的Lp－PLA2的酶活性明顯降低。但是，降脂機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

3．2 I198T點(diǎn)突變與2型糖尿病的相關(guān)性

本研究表明T2DM組中基因型TT的基因頻率顯著低于健康對(duì)照組，并且其Lp－PLA2酶活性水平最低；基因型IT與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)顯著。目前，對(duì)于1198T多態(tài)性與2型糖尿病的研究甚少。一項(xiàng)來(lái)自美國(guó)杜克大學(xué)的研究表明，無(wú)論是在家系研究中，還是在病例對(duì)照研究中，I198T基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)不明顯［11］。但是，另一項(xiàng)來(lái)自德國(guó)的研究表明，1198T多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)顯著，雜合子IT患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)要顯著低于基因II［12］。

綜上所述，Lp－PLA2可能成為早期預(yù)測(cè)2型糖尿病的指標(biāo)，并在早期發(fā)揮作用。但是，Lp－PLA2酶活性水平及其基因多態(tài)性在2型糖尿病過(guò)程中的確切作用機(jī)制尚有待于更深入的研究，明確他們之間的關(guān)系，篩查高危人群，將為2型糖尿病疾病的早期診斷和防治提供新的線索。因此，我們需要在不同種族、不同區(qū)域、不同性別的人群中進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，進(jìn)一步研究Lp－PLA2在2型糖尿病中的發(fā)病機(jī)制。

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