擬反相液相色譜法快速測定奶茶中咖啡因含量的研究

董麗麗，于 玲，李 敏，王力川

(邢臺學院 生物化學系，河北 邢臺 054001)

奶茶兼具牛奶和茶的雙重營養(yǎng)，由于美味可口、時尚休閑、方便快捷，深受廣大消費者的喜愛，尤其是以青少年消費群體為主。近年來，國內(nèi)奶茶市場正處在快速發(fā)展階段，多種品牌及不同口味的奶茶層出不窮。奶茶中含有生物堿、多種維生素、單寧酸、芳香油等300多種對人體有益的化學成份?？Х纫蚴悄滩柚械闹匾飰A，具有解除疲勞、興奮神經(jīng)、促進血液循環(huán)等作用，但大劑量或長期使用會損害人體健康，有成癮性，被列入受國家管制的精神藥品范圍。因此對食品中咖啡因的含量檢測是非常必要的。在咖啡因檢測中，最常見的是咖啡、茶、軟飲料中咖啡因的測定［1－10］，對奶茶中咖啡因的檢測則相對較少。擬反相色譜法［11］是以正相色譜所用的極性色譜柱為固定相，配以反相色譜的含水溶劑為流動相的色譜方法。相比于反相色譜和親水作用色譜，擬反相色譜的研究極少，已有報道主要是對保留行為的探討［12－16］，而利用擬反相色譜進行檢測的文獻并不多。本實驗將擬反相液相色譜法用于奶茶中咖啡因含量的測定，建立的方法所需有機相含量極低(僅占5%)，且分析速度快(5 min內(nèi)可完成樣品的分離測定)，極大地減少了有機試劑的耗費，同時也減少了對環(huán)境的污染。本研究是對食品中咖啡因檢測方法的補充，可用于樣品的日常測定，同時也可以促進色譜機理的進一步探討。

1 實驗部分

1.1 儀器條件與試劑

HPLC條件:島津LC－20AT高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器;色譜柱為InertsilHPLC Col-umn 100－5SIL(150mm×4.6mmi.d.5μm);流動相為0.03mol·L－1甲酸鈉溶液(pH 2.9)－乙腈(95∶5)，流速1.0mL·min－1，進樣量10μL。檢測波長274 nm。

咖啡因標準品由茶葉提取，升華提純。取適量溶于甲醇制備成5.133 g·L－1的標準儲備液，使用時用流動相稀釋至所需濃度。

12種不同品牌、不同口味及包裝(袋裝或杯裝)的奶茶均購自當?shù)匾患掖笮统小?/p>

乙腈、甲醇、異丙醇均為色譜純，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 樣品的制備

準確稱取各種奶茶約1 g，用適量85℃的水溶解后，用水定容至100 mL。移取10 mL離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，吸取10 μL進樣測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 有機溶劑類型的選擇 本文采用擬反相色譜法測定咖啡因。首先考察了流動相中有機溶劑類型對咖啡因保留的影響。保持其它條件相同，分別以甲醇、異丙醇、乙腈3種有機溶劑與甲酸鈉緩沖液(0.03 mol·L－1，pH 2.9)(5 ∶95)組成流動相，所得色譜圖見圖1。3種有機溶劑對溶質的洗脫強度按以下順序遞增:甲醇＜異丙醇＜乙腈。

圖1 有機溶劑類型對咖啡因保留的影響Fig.1 Influence of organic modifier on the retention of caffeine A.acetonitrile;B.isopropanol;C.methanol

由于甲醇是質子化溶劑，具有強的氫鍵作用能力，在硅膠表面可與水競爭吸附，流動相中的甲醇一部分吸附在固定相表面代替水分子。該條件下，流動相中甲醇的含量很低(只占5%)，此時會更低。而溶質的保留對流動相中有機相的含量極為敏感［12］。因此甲醇含量的輕微變化可導致溶質保留的迅速改變。3種溶劑中甲醇的氫鍵作用傾向大，吸附到固定相上的數(shù)量多，相當于流動相中有機相的含量降低，所以咖啡因的保留增強。與甲醇相比，異丙醇由于碳鏈的增長使其親水性降低，與固定相表面活性點的作用減弱，因而遺留在流動相中的數(shù)量相比甲醇要多，洗脫能力增強，所以咖啡因在其中的保留比在甲醇中弱。而乙腈是非質子化溶劑，不與固定相表面的硅羥基作用，存在于流動相中的乙腈數(shù)量相對較多，相當于流動相洗脫能力增強，所以咖啡因在其中的保留時間最短。

實驗結果表明，有機溶劑的類型對咖啡因的保留有著重要影響。由于待測物在乙腈中的洗脫時間最短，所得色譜峰最為尖銳、柱效高(n=31 600/m)、峰形對稱性好(As=1.161)，而在其它兩種體系中均出現(xiàn)嚴重拖尾現(xiàn)象，因此選擇乙腈體系測定咖啡因。

2.1.2 有機溶劑含量的選擇 進一步考察了流動相中乙腈含量對咖啡因保留值的影響(見圖2)。在乙腈含量小于50%時，隨流動相中乙腈含量的增加，溶質的保留值下降，表現(xiàn)出類似反相色譜的特性。類似結果也出現(xiàn)在阿替洛爾的分析中［17］，因此選擇乙腈的最佳含量為5%。

圖2 流動相中乙腈含量對咖啡因保留因子的影響Fig.2 Effect of ACN content in mobile phase on retention factors of caffeine

2.1.3 緩沖溶液pH值的選擇 流動相pH值同時影響到溶質和硅膠表面硅羥基的電離，進而影響溶質的保留。本實驗考察了pH值對咖啡因保留因子的影響。當pH值由2.5升至6.4的過程中，咖啡因的洗脫時間先隨pH值的增加而延長，達到最大值后，隨pH值的增加，保留反而減弱(見圖3)，說明擬反相色譜中溶質的保留機理是混合機理，除了分配作用，還存在一定的離子交換作用［16］。

圖3 pH值對咖啡因保留因子的影響Fig.3 Effect of pH value of mobile phase on retention factors of caffeine

2.1.4 離子強度的影響 由圖4可以看出，隨體系中甲酸鈉濃度的增加，咖啡因的保留時間不斷縮短。說明離子強度增加時，體系中帶正電荷的陽離子可與質子化的咖啡因競爭固定相上的活性保留中心，導致溶質的保留值減弱。與上述由pH值體現(xiàn)的擬反相色譜中溶質的保留機理是基于分配作用和離子交換作用的雙重作用相一致。

圖4 體系中離子強度對咖啡因保留時間的影響Fig.4 Effect of ionic strength in mobile phase on retention time of caffeine

通過上述實驗，結合保留強度和柱效等因素確定測定咖啡因的流動相為:乙腈與甲酸鈉緩沖液(0.03 mol·L－1，pH 2.9)(5 ∶95)。

2.2 線性范圍、檢出限、重現(xiàn)性及回收率

將配制好的系列濃度咖啡因標準溶液，按上述色譜條件進樣，以峰面積對咖啡因濃度(mg·L－1)作線性回歸分析。結果顯示，咖啡因的線性范圍為0.2～1 000 mg·L－1，相關系數(shù)(r)為0.999 5，檢出限(S/N=3)為0.05 mg·L－1。我國目前的國標中尚無對食品中咖啡因含量的規(guī)定(只有一個對于可樂飲料的咖啡因限定，含量不超過0.15 g·kg－1)［18］。該方法較寬的線性范圍可以滿足不同食品中咖啡因含量的測定。

精密吸取20 mg·L－1咖啡因標準溶液10 μL，進樣10次平行測定，測得峰面積的相對標準偏差為1.8%，保留時間的相對標準偏差為1.6%，說明該方法的重現(xiàn)性好。

在已知咖啡因含量的奶茶制備液中加入咖啡因標準液適量，加水稀釋、定容，過濾后吸取10 μL進樣，記錄色譜圖，每個樣品平行進樣5次，計算方法的回收率與相對標準偏差(見表1)。由表1可知，平均回收率為98%～103%，相對標準偏差為1.9%～3.6%，說明本方法具有很好的準確度和精密度。

表1 奶茶中咖啡因的加標回收率與相對標準偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of caffeine in milk tea(n=5)

2.3 實際樣品的測定

奶茶中的茶粉含有咖啡因，將所建立的擬反相液相色譜法用于12種奶茶中咖啡因含量的測定，以檢驗方法的實用性。所測12個樣品均經(jīng)溶解、離心、過濾處理后進樣測定，所得譜圖見圖5。由圖5可見，盡管不同品牌的奶茶組成復雜，成分各異，但除了目標物咖啡因的保留較強外，大多數(shù)組分在該色譜模式下幾乎無保留或保留很弱，使得咖啡因均可與共存干擾組分實現(xiàn)基線分離，表明該方法對咖啡因測定具有高選擇性。表2中列出了12種奶茶中咖啡因的含量。結果顯示，12種奶茶中咖啡因的含量在0.386 1～1.617 2 g·kg－1之間。目前，對于奶茶中咖啡因含量測定的研究未見報道，尚無數(shù)據(jù)可比較。國家衛(wèi)生標準可樂飲料的咖啡因限定含量為不超過0.15 g·kg－1［18］。如果將奶茶看作飲料，則其中咖啡因的含量均超出標準值;若當作茶看待，則低于茶葉中咖啡因的含量(一般＜40 g·kg－1)。但喜歡喝奶茶的人群主要為兒童、青少年，所以奶茶中的咖啡因需要謹慎對待。

圖5 奶茶中咖啡因的色譜圖Fig.5 Chromatograms of caffeine in milk tea the numbers denoted were the same as those in Table 2

表2 市售奶茶中咖啡因的測定結果(n=5)Table 2 Analytical result of caffeine in commercially available samples(n=5)

3 結論

本文利用擬反相液相色譜法快速測定了奶茶中咖啡因的含量，系統(tǒng)地探討了影響咖啡因保留的因素。與反相液相色譜法相比，硅膠色譜柱更為價廉，且該方法的分析速度快，在流動相中只需極少量的有機溶劑，即可實現(xiàn)快速高通量連續(xù)運行，極大節(jié)約了測試成本，同時降低了對環(huán)境的污染。該法的線性范圍寬、靈敏度好、回收率高、精密度好，可用于多種奶茶中咖啡因的測定。

［1］ vorc L，Tomcˇík P，Svítková J，Rievaj M，Bustin D．Food Chem．，2012，135(3):1198 －1204．

［2］ Guo S J，Zhu Q Q，Yang B C，Wang J，Ye B X．Food Chem．，2011，129(3):1311 －1314．

［3］ Alpdogan G，Karabina K，Sungurd S．Turk J.Chem．，2002，26(2):295－302．

［4］ Najafi N M，Hamid A S，Afshin R K．Microchem.J．，2003，75(3):151 －158．

［5］ Chen C N，Liang C M，Lai J R，Tsai Y J，Tsay J S，Lin J K．J.Agric.Food Chem．，2003，51(25):7495 －7503．

［6］ Srdjenovic B，Djordjevic－Milic V，Grujic N，Injac R，Lepojevic Z．J.Chromatogr.Sci．，2008，46(2):137 －143．

［7］ Zuo Y G，Chen H，Deng Y W．Talanta，2002，57(2):307－316．

［8］ Hideki H，Atsushi N，Tomomi U，Katsunori K．J.Chromatogr.A，2002，942(1/2):271－273．

［9］ Pura Naik J．J.Agric.Food Chem．，2001，49(8):3579 －3583．

［10］ Wang J Q，Jia L，Xia M．Mod.Food Sci.Technol．(王嘉琦，賈麗，夏敏．現(xiàn)代食品科技)，2011，27(1):114－116．

［11］ Crommen J．J.Chromatogr．，1979，186:705 －724．

［12］ Cox G B，Stout R W．J.Chromatogr.A，1987，384(2):315－336．

［13］ Gritti F，Pereira A S，Sandra P，Guiochon G．J.Chromatogr.A，2009，1216(48):8496－8504．

［14］ Gritti F，Pereira A S，Sandra P，Guiochon G．J.Chromatogr.A，2010，1217(5):683－688．

［15］ Li Y Y，Li J，Chen T，Liu X Y，Zhang H X．J.Chromatogr.A，2011，1218(11):1503－1508．

［16］ Li Y Y，Li J，Chen T，Liu X Y，Zhang H X．Anal.Chim.Acta，2012，726:102－108．

［17］ Dong L L，Wang C P．Chin.J.Anal.Lab.(董麗麗，王春平．分析試驗室)，2013，32(1):114－116．

［18］ GB 2760 －2011．Hygienic Standards for Uses of Food Additives．National Standards of the Peoples Republic of China(食品添加劑使用衛(wèi)生標準．中華人民共和國國家標準)．