硫磺與水楊酸配施對韭菜硝酸鹽累積及氮代謝的影響

李曉峰，王俊玲，李林妍，謝 鑫，高志奎*

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定071001;2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，河北保定071001)

葉類蔬菜喜硝態(tài)氮，極易引起硝酸鹽積累，不僅影響蔬菜的營養(yǎng)品質(zhì)［1］，還嚴(yán)重影響到人類的健康［2］?；凇拔沾笥谶€原”是導(dǎo)致硝酸鹽累積的觀點(diǎn)［3］，以往的大量研究普遍采用減控氮素供給的配方施肥等措施來降低硝酸鹽累積并取得了顯著成效［4－6］，本實(shí)驗(yàn)室的研究從促進(jìn)NO－3還原調(diào)控的角度入手，探索出積極有效地降低NO－3累積的措施［7－9］，水楊酸(salicylic acid，SA)效果尤為突出，可在降低NO－3含量的同時將液泡中累積的無效氮轉(zhuǎn)化合成氨基酸、蛋白質(zhì)等被植物體所利用。

現(xiàn)代植物生理生化研究表明，氮和硫兩元素在生理代謝，特別是蛋白質(zhì)合成方面表現(xiàn)出高度的協(xié)同關(guān)系［10］。硫的缺乏可使硝酸鹽的吸收和從根系到葉片的運(yùn)輸受到明顯的抑制，并且，隨著硫元素的持續(xù)匱乏，蛋白合成也將受到明顯的抑制［11］。Hawkesfordt等［12］認(rèn)為不充足的硫供應(yīng)導(dǎo)致暫時和穩(wěn)固的硝酸鹽積累或特殊的氨基酸庫混亂。一些研究利用土壤施用硫肥(硫酸鉀、硫磺、亞硫酸氫鈉等)的手段，在一定程度上降低了硝酸鹽的累積?；艚莸龋?3］研究發(fā)現(xiàn)小白菜葉面噴施NaHSO3，不僅能夠在一定程度上提高硝酸還原酶活性(NRA)，拉動氮素的還原同化，而且能夠通過提高PSⅡ電子傳遞能力和羧化反應(yīng)速率，促進(jìn)光合碳同化效率，可在碳骨架和能量供應(yīng)上拉動氮代謝的還原同化。張瑞杰等［14］的研究結(jié)果表明，施用硫磺能顯著降低土壤的pH值，從而有效地減少了土壤氮的氨揮發(fā)損失，可以明顯增加土壤含氮量和韭菜產(chǎn)量，同時能有效抑制NH+4向NO－3的轉(zhuǎn)化，降低葉片的硝酸鹽累積。葉面噴施水楊酸與土施硫肥配施能否降低硝酸鹽含量有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)以韭菜為材料，在前期獲得葉面噴施3 mmol/L水楊酸可降低韭菜硝酸鹽累積的基礎(chǔ)上，以硫直接調(diào)控氮代謝或通過調(diào)控硫代謝或碳代謝間接調(diào)控氮代謝為切入點(diǎn)，采用硫磺(根施)與水楊酸(葉面噴施)配施處理，分析韭菜葉片硝酸鹽含量，氮代謝相關(guān)酶活性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，探討硫磺與水楊酸配施降低韭菜硝酸鹽累積的調(diào)控機(jī)制，為挖掘積極有效型的蔬菜硝酸鹽污染調(diào)控措施及氮素高效利用提供理論依據(jù)，同時，為綠色蔬菜的栽培提供理論指導(dǎo)，以促進(jìn)中國無公害蔬菜生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2011年8月在河北省清苑縣謝莊日光溫室進(jìn)行，試材為3年生韭菜“新世紀(jì)雪韭”，農(nóng)藝管理按常規(guī)進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤為潮褐土，質(zhì)地粉砂壤，基本理化性狀為:有機(jī)質(zhì)17.4 g/kg、全氮1.01 g/kg、全磷0.96 g/kg、緩效鉀446 mg/kg、水解氮74.1 mg/kg、速效磷 9.7 mg/kg、硝態(tài)氮 9.5 mg/kg、速效鉀80.2 mg/kg、有效硫 11.8 mg/kg、pH 7.9、容重1.29 g/cm3。

2011年8月10 日，在前茬韭菜收割后第10 d進(jìn)行處理，將硫磺(S)和尿素混勻后溝施，施普通尿素240 kg/ha(含 N 46%)，設(shè)5個 S水平:0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2，硫磺為分析純;同時用 3 mmol/L水楊酸對韭菜進(jìn)行葉面噴霧處理(SA)，每個處理重復(fù)3次，以不噴水楊酸為對照(CK)，小區(qū)面積2.0 m2。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

于處理后第9d上午9點(diǎn)在每小區(qū)選取30株生長一致的韭菜，然后將樣品立即放入冰盒中進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。取韭菜相同部位的葉片(從葉柄處向上數(shù)第二片葉)，洗凈、吸干水分、剪碎混勻后為試驗(yàn)樣品。參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)采用丙酮－乙醇混合液法測定葉綠素含量［15］

硝酸鹽含量的測定［15］:稱取2 g韭菜，放入20 mL刻度試管中，加入10 mL蒸餾水，用玻璃泡封口，置于沸水浴中提取30 min。冷卻后過濾并用蒸餾水定容至25 mL，吸取提取液0.1 mL，加5%水楊酸—硫酸溶液0.4 mL，混勻后置室溫下20 min，加9.5 mL 8%NaOH后搖勻，冷卻至室溫后，在410 m波長處比色。

可溶性蛋白含量的測定［15］:稱取葉片0.5 g，剪碎于冷凍過的研缽中，加3 mL 50 mmol/L Tris－HCl，研磨，將勻漿倒入離心管中，再用 5 mL 50 mmol/L Tris－HCl將勻漿洗入離心管，然后在10000 r/min、4℃條件下離心20 min，取0.1 mL上清液試管中，再加Tris緩沖液0.9 mL，空白對照管加 Tris緩沖液1 mL，然后再加入考馬斯亮藍(lán)染色液5 mL，搖勻，在595 nm波長處比色。

酶活性的測定:NRA的測定參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法進(jìn)行［15］，NR以1h內(nèi)還原NO3－生成NO2－的 μg數(shù)表示酶活性，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性采用吳良?xì)g等［16］的測定方法。以上酶的提取和測定均在0～4℃條件下完成。

采用德國WALZ公司生產(chǎn)的調(diào)制式熒光成像系統(tǒng)(MINI－IMAGING－PAM)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定［17］。韭菜葉片暗適應(yīng)20 min后，在測量光［強(qiáng)度為 0.5 μmol/(m2·s)，脈沖頻率為 1 Hz］下誘導(dǎo)產(chǎn)生初始熒光(Fo)，隨后用飽和脈沖光［強(qiáng)度為2500 μmol/(m2·s)，脈沖光時間為 0.8 s］激發(fā)產(chǎn)生最大熒光(Fm)。當(dāng)熒光從最大值降到接近Fo水平時，用光化光［強(qiáng)度為156 μmol/(m2·s)］誘導(dǎo)熒光動力學(xué)，并每隔20 s打開飽和脈沖進(jìn)行熒光參數(shù)Fm’和F測定。在每個材料測定光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線后，從動力學(xué)曲線中導(dǎo)出所需要參數(shù)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

以上所有測定指標(biāo)重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及制圖，用SPSS 13.0 for Windows軟件檢驗(yàn)差異顯著性，LSD法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫磺(S)和水楊酸(SA)配施對韭菜葉片生長的影響

從表1可以看出，隨著硫(S)濃度的增加，對照(CK)和S配施處理的韭菜植株地上部鮮重和葉面積均表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。當(dāng)土壤施硫?yàn)镾 7.2 kg/hm2時，CK和SA配施處理韭菜鮮重均為最高，并且此時SA配施處理與CK相比鮮重增加了10.7%，增加效果最為明顯，可見適宜濃度的S與SA配施可以促進(jìn)韭菜生長，提高產(chǎn)量。

CK和S配施處理的韭菜葉片葉綠素含量均隨著硫濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當(dāng)S濃度為7.2 kg/hm2時，葉綠素含量達(dá)到最大，不施S時，葉綠素含量均為最小值(表1)。說明S與SA配施和單獨(dú)施S處理均對韭菜葉片葉綠素含量有調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)了韭菜的葉綠素的合成。不同濃度的S(0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2)與3 mmol/L 的SA配施，韭菜葉片的葉綠素總含量分別比對照(單施硫處理，CK)提高了2.36%、3.19%、2.01%、4.93%和3.78%。

表1 硫磺和水楊酸配施對韭菜生長和葉綠素含量的影響Table 1 Effects of S and SA on the growth and chlorophyll content of Chinese chive

2.2 硫磺(S)和水楊酸(SA)配施對韭菜硝酸鹽含量和硝酸還原酶活性(NRA)的影響

由圖1可知，對照和SA配施處理韭菜葉片的硝酸鹽含量均隨著硫濃度的增加呈現(xiàn)出先降低后增加的變化趨勢，當(dāng)土壤施硫?yàn)镾 7.2 kg/hm2時韭菜硝酸鹽含量最低;并且S和SA配施降低韭菜硝酸鹽的效果優(yōu)于S單獨(dú)施用。NRA是氮素同化的關(guān)鍵酶，單施硫(CK)處理和SA配施處理韭菜葉片的NRA隨施硫量的增加表現(xiàn)出與硝酸鹽含量相反的變化趨勢(圖1)，即先升高后降低，當(dāng)土壤施硫?yàn)镾 7.2 kg/hm2時，NRA最高，說明適宜濃度的硫可以提高NRA，但當(dāng)硫濃度過高時會抑制NRA。

圖1 硫磺和水楊酸配施對韭菜硝酸鹽含量和硝酸還原酶(NR)活性的影響Fig．1 Effects of S and SA on nitrate content and activity of NR of Chinese chive leaves

2.3 硫磺(S)和水楊酸(SA)配施對韭菜谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性的影響

GOT和GPT為氮代謝中2個重要的轉(zhuǎn)氨酶。SA配施和對照處理后的第9天，隨著硫濃度的增加，GOT和GPT活性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(圖2)。另外，從圖中還可以看出，在相同硫水平下，SA配施處理的韭菜葉片GOT和GPT活性均高于對照，并且隨著硫濃度的增加而逐漸增加，硫濃度為54.0 kg/hm2時GOT和GPT活性升至最高，比CK分別增加了13.6%和9.4%。

［注(Note):SA—葉面噴施3 mmol/L水楊酸Spraying within 3 mmol/L salicylic acid;CK—Spraying water．圖中不同字母表示5%水平差異顯著Different letters represent significant difference at 5%level．］

2.4 硫磺(S)和水楊酸(SA)配施對韭菜葉片PSⅡ原初光化學(xué)效率和電子傳遞速率的影響

從圖3可以看出，隨著硫濃度的升高，CK和SA配施處理的韭菜葉片F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，但CK處理的變化幅度較小。另外，與CK相比，SA配施處理提高了韭菜葉片的Fv/Fm，當(dāng)硫的濃度為7.2 kg/hm2時Fv/Fm的增加效果最為明顯。反映出SA配施處理能保證韭菜葉片具有較高的能量轉(zhuǎn)化效率，為葉片的生長發(fā)育提供了更多的化學(xué)能，進(jìn)而促進(jìn)葉片內(nèi)部的物質(zhì)代謝。

圖3結(jié)果還表明，SA配施處理顯著提高了韭菜葉片的 ETR，不同濃度的 S(0、7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2)與3 mmol/L的SA配施，其ETR分別比CK提高了23.3%、21.20%、27.11%、19.38%和14.16%。并且，隨著硫濃度的增加，SA配施和CK處理的韭菜葉片的ETR均隨著硫濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖3 硫磺和水楊酸配施對韭菜葉片F(xiàn)v/Fm和ETR的影響Fig．3 Effects of S and SA on Fv/Fm and ETR of Chinese chive leaves

2.5 硫磺(S)和水楊酸(SA)配施對韭菜可溶性蛋白含量和干物質(zhì)積累的影響

圖4顯示，韭菜葉片的可溶性蛋白含量隨硫濃度的增加而增加，S濃度為 7.2、18.0、36.0、54.0 kg/hm2的處理比0 kg/hm2分別提高了13.9%，9.9%，6.6%和5.2%，反映出施硫可提高代謝所需的酶，從而促進(jìn)了韭菜葉片的物質(zhì)代謝。另外，SA配施處理也提高了不同硫水平下韭菜葉片的可溶性蛋白含量，除S濃度為0 kg/hm2和7.2 kg/hm2兩處理外，可溶性蛋白增加的效果顯著。

圖4 硫磺和水楊酸配施對韭菜葉片可溶性蛋白含量和干物質(zhì)積累的影響Fig．4 Effects of S and SA on the soluble protein content and dry weight of Chinese chive leaves

植物的干重在一定程度上可以反映植物在一段時間內(nèi)的干物質(zhì)積累量。本試驗(yàn)中，不同硫水平下的韭菜幼苗干重隨著硫濃度的增加也表現(xiàn)出逐漸呈增加的趨勢(圖4)，其中，在S濃度為7.2和18.0 kg/hm2時增加效果最為明顯，分別比0 kg/hm2提高了16.04%和13.44%。另外，與CK相比，水楊酸配施處理也提高了韭菜葉片的干物質(zhì)積累量，但增加效果無明顯的規(guī)律性。

3 討論與結(jié)論

前人研究表明，植物體的氮素同化和硫素同化過程彼此依賴，相互協(xié)調(diào)［10］，氮硫配合施用可顯著增加植株干物質(zhì)產(chǎn)量，氮、硫含量和吸收量［18］，但植株內(nèi)氮、硫含量及其比值受基因型和氮、硫供給水平的影響［19］。周杰等［18］認(rèn)為氮素和硫素在適量范圍內(nèi)，二者存在互促效應(yīng)，供應(yīng)水平過高，則相互抑制，不利于小麥對氮、硫的吸收和利用。朱云集［20］的研究認(rèn)為，在較高施氮量條件下適當(dāng)施硫有利于小麥籽粒產(chǎn)量的提高，而在低氮條件下施氮施硫會導(dǎo)致減產(chǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在240 kg/hm2尿素水平下，施硫均可降低韭菜硝酸鹽含量，提高韭菜的可溶性蛋白含量和干物重，且當(dāng)硫濃度為7.2 kg/hm2時的效果最為明顯，說明適宜的氮、硫供應(yīng)可能促進(jìn)了韭菜體內(nèi)的氮、硫代謝平衡，推動了氮素的還原同化及蛋白質(zhì)的合成。

在氮代謝(NO－3→NO2－→NH+4→谷氨酰胺→谷氨酸→氨基酸→蛋白質(zhì))的整個途徑中，NR作為重要的調(diào)節(jié)酶和限速關(guān)鍵酶，由它來調(diào)控整個氮素還原同化進(jìn)程［21］。一些研究利用土壤施用硫肥(硫酸鉀、硫磺等)的手段，在一定程度上調(diào)節(jié)植株氮、硫代謝過程中的關(guān)鍵酶活性［22］，同時促進(jìn)植株的碳－氮(C－N)運(yùn)轉(zhuǎn)，提高植株對氮的吸收利用。本試驗(yàn)中，硫磺(S)與水楊酸(SA)配施和硫單施處理韭菜葉片硝酸還原酶活性(NRA)均隨著硫濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，說明適宜濃度的硫有促進(jìn)韭菜葉片硝酸還原酶的生成和激活作用，而硫濃度過高反而會降低NRA，可能是由于硫濃度過高會導(dǎo)致氮、硫同化競爭活化能量，表現(xiàn)出對硝酸還原酶的抑制，從而影響植物氮代謝的順利進(jìn)行［22］。SA在植物信號傳導(dǎo)和抗逆反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［23］，在一定濃度范圍內(nèi)還可以調(diào)節(jié)根系離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，誘導(dǎo)NR活性［9］，對氮素的吸收和還原起到積極的推動作用，本試驗(yàn)中S和SA配施韭菜葉片NR活性均比硫單獨(dú)施用高，在提高氮還原動力泵NR活性上表現(xiàn)出較高的協(xié)同效應(yīng)，反映了SA對推動氮素的還原，減少韭菜的NO3－累積發(fā)揮了重要作用。NR活性的提高可能是由于SA和S的直接作用，也可能是因?yàn)閮烧吲涫┯绊懼参锛に兀奂?xì)胞分裂素(CTK)和生長素(IAA)］代謝而產(chǎn)生的間接作用，還可能是發(fā)生在NR mRNA轉(zhuǎn)錄水平上［24］。

盡管在整個氮代謝途徑中硝酸還原酶(NR)為限速關(guān)鍵酶，但是還需要銨同化、呼吸作用和光合作用［提供的還原能力(NADH/NADPH/Fd)、ATP和C－骨架］、以及轉(zhuǎn)氨作用(繼谷氨酸轉(zhuǎn)氨作用后形成其它氮轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸狀況)的協(xié)同配合［9］。

植物細(xì)胞為避免NH+4的毒害作用，會迅速將由NH+4通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶(GS/GOGAT)循環(huán)轉(zhuǎn)移到谷氨酸，然后在GOT和GPT等轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為其他氨基酸。朱云集等［22］研究結(jié)果表明，在適量供氮條件下，施硫不會引起硫同化酶活性的升高，但可調(diào)節(jié)氮同化酶的活性，維持小麥植株體內(nèi)氮素和硫素同化在適度水平，以滿足其生理代謝的需求。本研究中，隨著硫濃度的增加，GPT和GOT活性均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，GOT和GPT活性的提高對保證氮的同化有積極的作用。尤其是在高硫濃度和NRA較低的情況下，S和SA配施處理促進(jìn)了氮同化和轉(zhuǎn)氨作用的協(xié)同進(jìn)行，從而拉動了氮素的還原，減少了韭菜的硝酸鹽累積。

硫是葉綠素、輔酶等合成的重要介質(zhì)，它能提高葉綠素體內(nèi)鐵的活性，增加葉綠素含量，另外，硫構(gòu)成參與光合作用過程的硫氧還蛋白、鐵硫蛋白(FeS)、Rieske氏鐵硫蛋白和鐵氧還蛋白(Fd)等，參與光合電子的傳遞，促進(jìn)形成暗反應(yīng)的同化力ATP和NADPH［25］。本研究獲得S和SA配施可提高韭菜葉片葉綠素含量的結(jié)果，并且還可促進(jìn)PSⅡ的光能吸收與傳遞更多的能量，為氮代謝(如亞硝酸鹽還原和氨同化)和硫代謝(如硫酸鹽還原)等提供充裕的能量，提高光合效率。光合作用的改善對提高生物累積量、可溶性糖、C－骨架和韭菜產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。另外，S和SA配施后韭菜葉片生長量增大，對硝態(tài)氮產(chǎn)生了稀釋效應(yīng)，使單位重量蔬菜的NO3－含量下降，從而降低了硝酸鹽的累積。

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