貓豆炭疽病病原分離與鑒定

葉云峰， 付 崗， 劉 威， 蔣 妮， 劉麗輝， 胡鳳云

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點實驗室，南寧 530023；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，南寧 530007）

貓豆［Mucunapruriens（Linn.）DC.］，別名刺毛黧豆、狗爪豆、貓爪豆、龍爪豆、虎爪豆等，是豆科黧豆屬一年生藤本植物。貓豆在非洲、印度和加勒比均有種植，在我國主要分布于亞熱帶石山地區(qū)［1］。廣東、廣西、貴州、海南、臺灣和云南等南部省區(qū)均有種植，其中，廣西是貓豆的主產(chǎn)區(qū)，種植面積超過1 500 hm2。貓豆種子是生產(chǎn)治療帕金森氏病的經(jīng)典藥物左旋多巴的重要原材料［2］，還含有抵抗蛇毒［3］和抗糖尿?。?］的活性成分，并具有壯陽活性，民間用于治療性障礙［5］。此外，貓豆還具有重要的食用價值和飼料價值。目前，貓豆在廣西已經(jīng)形成了“種植—加工—養(yǎng)殖／醫(yī)藥化工”產(chǎn)業(yè)鏈。近年來，隨著貓豆在廣西種植面積的增加，出現(xiàn)了一些危害較重的病蟲害，其中，炭疽病為主要病害，發(fā)病率為30%左右，病重地塊達(dá)70%，主要危害貓豆的葉片、莖蔓和豆莢，大大降低了貓豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病在廣西的龍州縣、隆安縣、天等縣、貴港市等地均有發(fā)生。目前尚無該病病原的報道，作者對廣西貓豆炭疽病病原進(jìn)行分離和鑒定，以期為該病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

患病的貓豆病株采自廣西壯族自治區(qū)龍州縣八角鄉(xiāng)。對田間自然感病植株進(jìn)行癥狀描述。

1.2 病原菌的分離純化

選取貓豆葉片、莖蔓及豆莢的病健交界處病組織，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用無菌水漂洗3次，置于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，純化后的菌落通過單孢分離獲得純培養(yǎng)分離物。

1.3 分離物的致病性測定

1.3.1 室內(nèi)離體接種

將純培養(yǎng)的分離物菌絲塊通過針刺接種法接種到健康的貓豆葉片、莖稈及豆莢上，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，以針刺傷口處放PDA培養(yǎng)基塊的葉片、莖稈及豆莢為對照，定期觀察各組織的發(fā)病情況，發(fā)病后再對病斑進(jìn)行病原菌分離。

1.3.2 田間接種

將在PDA上培養(yǎng)7 d的分離物配成孢子懸浮液（105個孢子／mL），噴施于田間種植的健康的貓豆葉片、莖稈及豆莢上，設(shè)刺傷和無傷口接種2個處理，以噴施無菌水的植株為對照，每處理接種20株貓豆，定期觀察發(fā)病情況，發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察病原菌在PDA平板上的菌落特征，顯微觀察菌絲體、分生孢子等的形態(tài)特征，對病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

病原菌DNA提取采用CTAB法［6］。以ITS4 5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′ 和 IT5 5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′為 引 物，PCR擴(kuò)增菌株的ITS r DNA序列。反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，體系含有10×Ex Buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol／L）1μL，Primer ITS4 （10μmol／L）2μL，Primer ITS5 （10μmol／L）2μL，Genomic DNA 100 ng，ExTaq（5 U／μL）0.5μL；dd H2O 補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃復(fù)性80 s，33個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)DNA片段，由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

該病主要危害貓豆的葉片、莖蔓和豆莢。葉片感病后，病斑從葉尖或葉緣呈“V”字形或不規(guī)則形向葉片中間部位擴(kuò)展，病斑初始為黃色，后變褐色、干枯，病斑周圍黃色，病葉后期穿孔。莖蔓上的病斑初始為近圓形或不規(guī)則形褐色斑，隨后朝橫向和縱向擴(kuò)展成黑褐色大斑，病斑稍凹陷，嚴(yán)重時導(dǎo)致莖蔓枯死。豆莢感病后在表面形成黑色近圓形或不規(guī)則形凹陷病斑，多個病斑擴(kuò)大融合成片，使豆莢癟小或生長不良，天氣潮濕時，在病斑上形成粉紅色黏性物（圖1）。該病害在貓豆的成株期至生長后期（6月－11月）均可發(fā)生，最早在葉片上出現(xiàn)癥狀，隨后感染莖蔓和豆莢。種植密度大、偏施氮肥的地塊發(fā)病較重；高溫多雨時期發(fā)病較重，蔓延迅速。

圖1 貓豆炭疽病田間癥狀Fig.1 Natural symptoms of velvet bean anthracnose

2.2 病原菌的分離和致病性測定

對貓豆葉片、莖蔓和豆莢各5個病害標(biāo)樣進(jìn)行病原分離，分離純化得到形態(tài)特征一致的菌株21株。這些菌株經(jīng)針刺法接種到離體的葉片、莖蔓和豆莢上，發(fā)病率可達(dá)100%。接種后第3天，葉片發(fā)病，第7天，莖蔓和豆莢發(fā)病，均在接種部位形成黑色近圓形病斑，癥狀比田間自然發(fā)病癥狀較重（圖2）。田間刺傷法接種的植株發(fā)病較早，接種病原后第7天，葉片發(fā)病，第12天莖蔓和豆莢開始發(fā)病，發(fā)病率為100%。無傷口接種的植株發(fā)病時間晚7～10 d，發(fā)病率為70%。田間接種的癥狀和自然發(fā)病癥狀相同。對照植株不發(fā)病。從發(fā)病的病斑上能再分離到與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。

圖2 貓豆炭疽病離體接種癥狀Fig.2 Inoculation symptoms of velvet bean anthracnose

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA平板上，菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變?yōu)榛野咨蛏罨疑?，菌絲排列整齊，毛絨狀。培養(yǎng)7 d后，靠近菌落中央產(chǎn)生輪紋狀排列的分生孢子盤，并在其上產(chǎn)生紅色分生孢子團(tuán)。分生孢子盤圓形或橢圓形，黑褐色，直徑（100～300）μm；剛毛少，暗褐色，橫隔1～2個，（65～70）μm×（5～6）μm；分生孢子梗短，圓筒形，基部淺褐色，（12～20）μm×（4～5）μm；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大?。?1.5～20.3）μm×（4.2～6.0）μm，平均為15.9μm×5.1μm（圖3）。參照《真菌鑒定手冊》［7］及《植物病原真菌學(xué)》［8］，將該病原菌鑒定為膠孢炭疽菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）］。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將病原菌的DNA通過PCR擴(kuò)增后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得530 bp的DNA序列（圖4）。該序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比較，與已報道的多個膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）及其有性態(tài)圍小叢殼 菌 ［Glomerellacingulata（Stonem.）Spauld.et Schrenk］的序列相似性最高，相似性達(dá)99%～100%。

圖3 貓豆炭疽病病原形態(tài)Fig.3 Pathogen morphology of velvet bean anthracnose

圖4 貓豆炭疽病病原菌的ITS r DNA序列Fig.4 ITS r DNA sequence of the velvet bean anthracnose pathogen

3 結(jié)論與討論

近年來，貓豆在廣西大面積種植，已經(jīng)成為部分農(nóng)民脫貧致富的途徑之一，然而，貓豆炭疽病的發(fā)生給貓豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民的增收產(chǎn)生較大的影響，至今尚無關(guān)于該病的研究報道。為明確該病病原和有效控制病害的發(fā)生，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)特性，將該病原鑒定為膠孢炭疽菌。膠孢炭疽菌是世界上分布最廣的植物病原菌之一，危害多種寄主植物，但該病原危害貓豆為國內(nèi)首次報道。此外，膠孢炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質(zhì)性等方面可分成許多亞組，屬多形態(tài)種［9］，對所獲得的菌株的寄主范圍及專化型的確定尚待進(jìn)一步的工作。由于膠孢炭疽菌引起的多種植物病害的侵染循環(huán)和發(fā)病條件相似，因此，可參考由該病原引起的其他作物炭疽病的防治方法進(jìn)行控制，如選用無病種子或進(jìn)行種子消毒、及時清除病殘體、合理密植、創(chuàng)造良好的通風(fēng)透光條件、合理施肥用水等，或在發(fā)病初期使用25%咪鮮胺乳油1 500倍液噴霧［10］。具體防治藥劑及綜合防治技術(shù)的建立尚待室內(nèi)篩選試驗和田間實踐驗證。

［1］王慧忠，何翠屏.喀斯特地區(qū)的高產(chǎn)飼料作物—狗爪豆［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，1999，18（2）：81－84.

［2］陳海波.帕金森病的左旋多巴治療史及現(xiàn)狀［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2004，23（7）：451－452.

［3］Tan N H，F(xiàn)ung S Y，Sim S M，et al.The protective effect ofMucunapruriensseeds against snake venom poisoning［J］.Journal of Ethnopharmacology，2009，123（2）：356－358.

［4］Majekodunmi S O，Oyagbemi A A，Umukoro S，et al.Evaluation of the anti－diabetic properties ofMucunapruriensseed extract［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2011，4（8）：632－636.

［5］Suresh S，Prithiviraj E，Prakash S.Dose－and time－dependent effects of ethanolic extract ofMucuna pruriensLinn.seed on sexual behaviour of normal male rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，2009，122（3）：497－501.

［6］易潤華，朱西儒，周而勛.簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA［J］.湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2003，23（6）：72－73.

［7］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？萍汲霭嫔?，1979：468－475.

［8］陸家云.植物病原真菌學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：449－459.

［9］譚海文，黎起秦，葉靖平，等.闊葉十大功勞炭疽病初報［J］.植物病理學(xué)報，2010，40（4）：446－448.

［10］蔡志英，李加智，賀麗瓊，等.咪鮮胺對橡膠炭疽菌的抑制作用［J］.中國食用菌，2008，27（S1）：25－26.