多肽固相合成研究進(jìn)展

黃 蓓

(河南省化工研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450052)

多肽是普遍存在于生物體內(nèi)由氨基酸組成的化學(xué)物質(zhì)，迄今在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多肽已達(dá)數(shù)萬種，由于其具有廣泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到藥物研發(fā)工作者的重視。尤其在20世紀(jì)90年代以后，隨著多肽合成技術(shù)的日臻成熟，越來越多的活性多肽已被開發(fā)并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域［1］。

1 多肽概述

由于活性多肽類物質(zhì)的重要性，合成這些活性物質(zhì)就成了生物化學(xué)家研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。而多肽的合成主要是指化學(xué)合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成兩種途徑。液相法在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)方面有非常重要的應(yīng)用。固相合成法在20世紀(jì)60年代被提出，與經(jīng)典的液相合成多肽方法相比，由于固相合成大大簡化了后處理操作步驟，可以得到較高的收率和產(chǎn)物純度，易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)，近幾十年來在合成活性多肽類物質(zhì)方面得到了極大的發(fā)展與應(yīng)用。

2 多肽的固相合成

1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis)，為多肽研究開辟了廣闊的天地，并極大地推動了分子生物學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，為此1984年Merrifield被授予了諾貝爾化學(xué)獎［2］。

2.1 固相合成的基本原理

多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，合成一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先將目的肽第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體相連，再以這一氨基酸的氨基為合成起點(diǎn)，經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化的第二個氨基酸反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)(縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。

2.2 合成方法

目前固相合成多肽主要有兩種方法:一是叔丁氧碳基合成法(Boc合成法);二是9-甲氧羥基合成法(Fmoc合成法)。

圖1 多肽固相合成的基本原理

2.2.1 Boc 合成法

采用三氟乙酸(TFA)可脫除的Boc為α-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類。合成時將一個Boc保護(hù)的α-氨基酸共價交聯(lián)到樹脂上，用TFA脫除Boc，三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過DCC活化、偶聯(lián)下一個氨基酸，最終采用強(qiáng)酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標(biāo)多肽從樹脂上解離。在Boc合成法中，由于要反復(fù)地用酸來脫保護(hù)以便進(jìn)行下一步的偶聯(lián)，這就引入了一些副反應(yīng)，如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定并發(fā)生副反應(yīng)。

2.2.2 Fmoc 合成法

1978年，Meienlofer和 Atherton等人發(fā)展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)作為α-氨基保護(hù)基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中，采用了可被堿脫除的Fmoc作為α-氨基酸的保護(hù)基，側(cè)鏈采用酸脫除的Boc保護(hù)方法。Fmoc作為氨基保護(hù)基的優(yōu)點(diǎn)在于它對酸穩(wěn)定，用TFA等試劑處理不受影響，僅需用溫和的堿處理，側(cè)鏈用對堿穩(wěn)定的Boc進(jìn)行保護(hù)等［3］。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地從樹脂上切除，避免了采用強(qiáng)酸［4］。Fmoc法與Boc法相比，由于Fmoc法反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，而被廣泛應(yīng)用于多肽合成中。

2.3 固相合成的聚合物載體與鏈接分子

2.3.1 聚合物載體

將固相合成與其他多肽合成技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體［5］，而能被用作多肽固相載體的聚合物必須滿足以下條件:①必須包含合適的連接分子(或反應(yīng)基團(tuán))，使肽鏈能連接在載體上面，并在以后除去。②必須在合成過程中保持穩(wěn)定并且不與氨基酸分子反應(yīng)。③必須提供足夠的連接點(diǎn)，以滿足肽鏈的不斷增長的需要。目前用于固相合成的聚合物載體主要有三類:聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇類樹脂及衍生物。這些聚合物載體只有引入相應(yīng)的連接分子，才能與氨基酸進(jìn)行連接。根據(jù)連接分子的不同，樹脂又被分為幾種類型:氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。

2.3.2 連接分子

一個理想的連接分子必須在整個合成過程中十分穩(wěn)定，并在合成后可以定量的切割下來而又不破壞合成的目標(biāo)分子［6］，同時連接分子還需要根據(jù)與樹脂相連的肽的C端的結(jié)構(gòu)類型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物來選擇［7］。固相多肽合成使用過的連接分子為含有氯甲基、巰甲基、酰氯基、對苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二?；⑧徬趸S醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團(tuán)化合物。

2.4 肽鍵的形成

固相中肽鍵的形成原理與液相中的基本一致，應(yīng)用的方法主要有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中選用 DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法由于在肽鍵的形成過程中可以減少副反應(yīng)并抑制消旋的發(fā)生，最終得到的多肽收率高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用最廣［8］。

近幾十年，隨著多肽合成研究的逐步深入，越來越多的肽鍵縮合劑被設(shè)計(jì)出來［9-11］(如見圖2所示)。DCC、DIC等碳二亞胺類縮合劑，正被更高效的HBTU、BOP、HATU這類脲陽離子和磷正離子的HOBt或HOAt縮合體系取代［12］。這類縮合劑的優(yōu)點(diǎn)在于克服了DCC在反應(yīng)過程中產(chǎn)生沉淀的缺點(diǎn)，而且縮合效率明顯提高，副反應(yīng)少，出現(xiàn)的副產(chǎn)物也容易被洗滌出接肽反應(yīng)體系，且合成目的肽的光學(xué)純度高。特別是隨著Fmoc多肽合成法的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展，其縮合劑多采用 TBTU 、HOBt 、DIEA［13-14］，這種縮合劑體系明顯縮短了接肽反應(yīng)時間，減少了副反應(yīng)，抑制了消旋現(xiàn)象的發(fā)生。這些新型的縮合劑及其體系正被應(yīng)用到更多的合成多肽的反應(yīng)當(dāng)中。

圖2 常見縮合劑

2.5 多肽的切割與沉淀

按既定的順序合成完多肽后，就要把目標(biāo)多肽從樹脂上切割下來，并進(jìn)行進(jìn)一步的純化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法兩種，因此，它們的切割方法也不完全一樣。在Boc法中，主要用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)。在Fmoc法中直接用TFA進(jìn)行切割。以Fmoc法的切割為例，首先將反應(yīng)的樹脂用二氯甲烷洗滌幾遍后，真空抽干。往裝有樹脂的多肽固相反應(yīng)器中緩慢加入:三氟乙酸/三異丙基硅烷/ 水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(體積比)溶液，反應(yīng)3 h，過濾，氮?dú)獯等ゴ蟛糠值娜軇┖螅驓堃褐械谷腩A(yù)先冷凍的無水乙醚，離心，倒去上層溶劑乙醚，向沉淀中再次加入無水乙醚，振蕩，離心，再重復(fù)一次，除去大部分的雜質(zhì)。將得到的沉淀真空干燥24 h。固體殘留物用離子水溶解，冷凍干燥得到白色絮狀固體，-20℃保存。

2.6 多肽的純化

合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等［15］。目前應(yīng)用最多的是高效液相色譜法，其具體的步驟:將凍干的粗品多肽，溶于20%乙腈/水溶液，用含有0.6%TFA的乙腈/水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集主要峰產(chǎn)物，減壓旋蒸除去乙腈，在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥，將目標(biāo)多肽產(chǎn)品放在-20℃保存。

3 展望

由于多肽類藥物在治療某些疾病方面具有獨(dú)特的療效，因此，近幾十年來已經(jīng)引起越來越多的生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的關(guān)注。隨著多肽固相合成的提出和發(fā)展，人們可以相對簡單地用設(shè)計(jì)合成的多肽分子來進(jìn)行生物活性的研究等工作。但是，目前人們還只能合成一些相對較短的肽鏈，而對于相對分子質(zhì)量較大、肽鏈較長的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，固相合成技術(shù)還有很大的局限性，同時在合成中要用到大量的有毒試劑，合成費(fèi)用昂貴，并伴隨副反應(yīng)、消旋化等問題，這些都是不可忽視的問題。因此，尋找更加綠色、環(huán)保的多肽合成技術(shù)，對科學(xué)家來說也是一個重大的挑戰(zhàn)。

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