頭孢拉宗與兩種氨基糖苷類抗菌藥物聯(lián)用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的聯(lián)合藥敏研究

孫 艷，王 沭，邵曉迪，白 艷，王 睿（. 解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 0085；. 總后司令部管理保障局第三門診部，北京 0009；. 解放軍總醫(yī)院藥物臨床研究中心，北京 0085）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae, EC）廣泛存在于自然界中，是人體腸道正常菌群之一，為常見的條件致病菌，既可通過外源性引起感染，也會由于機(jī)體免疫力降低，不合理使用抗菌藥物而引發(fā)內(nèi)源性感染，引起呼吸道、尿道、傷口感染及敗血癥等[1-3]。陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因，少數(shù)的陰溝腸桿菌還會產(chǎn)碳青霉烯酶，或同時(shí)產(chǎn)生以上酶從而導(dǎo)致多重耐藥[4-5]，給臨床治療此類感染帶來極大挑戰(zhàn)。頭孢拉宗（cefbuperazone, CBPZ）是日本富山化學(xué)工業(yè)制藥株式會社研發(fā)的頭孢類抗菌劑，1985年首次在日本上市。頭孢拉宗是第三代頭霉素類抗菌藥物，對多種革蘭陰性菌具有較高的抗菌活性，具有7α-甲氧基取代基的頭霉素結(jié)構(gòu)，使其對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌也有一定的抗菌活性。其作用機(jī)制與其他頭孢菌素類抗菌藥物相似，主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成從而發(fā)揮殺菌作用[6]。雖然頭孢拉宗對產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌有效，但是對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌尚不能完全抑制。氨基糖苷類藥物是具有氨基糖與氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)的一類抗生素，臨床上主要用于治療敏感需氧革蘭陰性桿菌所致的全身感染。阿米卡星（amikacin, AMKC）、異帕米星（isepamicin,IPMC）均為氨基糖苷類抗菌藥物，對多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬等具有良好的抗菌作用。其對許多腸道革蘭陰性桿菌所產(chǎn)生的氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，不會被此類酶鈍化而失去抗菌活性，交叉耐藥性少，而且這兩種抗生素與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物等聯(lián)用具有協(xié)同作用。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究頭孢拉宗分別與阿米卡星和異帕米星對臨床分離的11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)，探討聯(lián)合應(yīng)用頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星是否顯示協(xié)同作用，以期為臨床控制產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的感染，合理聯(lián)用抗菌藥物時(shí)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株來源

11株來自中國人民解放軍總醫(yī)院2011年3月的陰溝腸桿菌非重復(fù)臨床分離菌株，全部來源于住院患者送檢的痰液臨床標(biāo)本，采用雙紙片法檢驗(yàn)，經(jīng)鑒定為產(chǎn)ESBLs和AmpC酶陰溝腸桿菌。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 培養(yǎng)基

Mueller-Hinton Broth（MH）營養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；Mueller-Hinton Agar（MH）培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 抗菌藥物

頭孢拉宗（韓諾株式會社，規(guī)格：0.2 g，批號：1026145）；阿米卡星（中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格：100 mg，批號：130335-200204）；硫酸異帕米星注射液（旭化成制藥株式會社，規(guī)格：200 mg/2 mL，批號：EXA11CY）

1.4 儀器

比濁儀（法國梅里埃公司）；連續(xù)微量加樣器（美國Eppendorf公司）；八導(dǎo)微量加樣器（美國Eppendorf公司）；96孔平板（愛思進(jìn)醫(yī)用塑料（臺州）有限公司）。

2 方法

2.1 菌懸液的配制

從已分純并過夜新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取4 ～5個(gè)菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h（恒溫，震蕩培養(yǎng)）。菌液用3 mLMH肉湯校正比濁儀濁度至0.5 MacFarland，再用MH肉湯稀釋至1. 5×105cfu·mL-1。

2.2 抗菌藥物儲備液的配制

精密稱取適量頭孢拉宗和阿米卡星，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會CLSI（2012）以相應(yīng)溶劑溶解，25 mL容量瓶中定容，含藥儲備液濃度均為1024 μg·mL-1，然后進(jìn)行分裝冷藏，備用。硫酸異帕米星注射液直接分裝，配成1024 μg·mL-1含藥儲備液，冷藏備用。

2.3 測定方法

2.3.1 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）的測定 用微量肉湯稀釋法測定單個(gè)藥物的MIC，以CLSI（2012）標(biāo)準(zhǔn)判讀敏感性；同時(shí)計(jì)算MIC范圍，半數(shù)抑菌濃度（MIC50），90%抑菌濃度（MIC90）和抑菌濃度幾何均數(shù)（MICG）。

2.3.2 FIC的測定 將頭孢拉宗以滅菌MH肉湯倍比稀釋成11個(gè)濃度，分別為256，128，64，32，……，0.5 μg·mL-1；阿米卡星和異帕米星以滅菌MH肉湯倍比稀釋成7個(gè)濃度，分別為16，8，4，2，……，0.25 μg·mL-1。將不同濃度的兩種抗菌藥物按棋盤法設(shè)計(jì)，兩兩組合加入96孔平板中，每種抗菌藥物取50 μL，再將1.5×105cfu·mL-1的菌液100 μL加入孔中，頭孢拉宗的最終濃度為64，32，16，8，……，0.125 μg·mL-1；阿米卡星和異帕米星的最終濃度為4，2，1，0.5，……，0.062 5 μg·mL-1；菌懸液最終濃度為7.5×104cfu·mL-1，37 ℃過夜（20±2） h培養(yǎng)。觀察結(jié)果，記錄單獨(dú)應(yīng)用兩藥的最低抑菌濃度MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并選擇最佳組合效應(yīng)時(shí)，兩藥聯(lián)合時(shí)各自的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用，以計(jì)算FIC指數(shù)。

2.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1 MIC結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行抗菌藥物最低抑菌濃度測定，無菌生長96孔平皿的最低藥物濃度為該藥對該株細(xì)菌的MIC。雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌對頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星的折點(diǎn)結(jié)果判定及質(zhì)控菌ATCC25922質(zhì)控范圍參考國外文獻(xiàn)及CLSI（2012）見表1。質(zhì)控跟隨每批實(shí)驗(yàn)，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2.4.2 FIC指數(shù)的計(jì)算與判定標(biāo)準(zhǔn)[7]FIC指數(shù) =MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。FIC≤0.5，協(xié)同作用；0.5 ＜ FIC ＜ 1，部分協(xié)同作用；FIC = 1，相加作用；1 ＜ FIC≤4，無關(guān)作用；FIC ＞ 4，拮抗作用。

表1 抗菌藥物MIC判定標(biāo)準(zhǔn). μg·mL-1Tab 1 Interpretive standards for the values of MIC of antibacterials. μg·mL-1

3 結(jié)果

3.1 頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星單用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC及耐藥性

頭孢拉宗對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是32 μg·mL-1和128 μg·mL-1，敏感率為45.45%，耐藥率為27.27%；阿米卡星對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是2 μg·mL-1和4 μg·mL-1，異帕米星對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是0.25 μg·mL-1和1 μg·mL-1，敏感率高，且均為90.91%，耐藥率也相同，均為9.09%。具體見表2。

表2 頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星單用對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌MIC及耐藥性. n = 11，μg·mL-1Tab 2 The results of MIC and drug resistance on CBPZ or AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

3.2 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯(lián)用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC

單用頭孢拉宗對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC50為32 μg·mL-1，聯(lián)用阿米卡星時(shí)，MIC50下降到4 μg·mL-1，聯(lián)用異帕米星時(shí)，MIC50下降到2 μg·mL-1。單用阿米卡星對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC50為2 μg·mL-1，異帕米星的MIC50為0.25 μg·mL-1；與頭孢拉宗聯(lián)用，阿米卡星的MIC50下降到0.5 μg·mL-1，異帕米星的MIC50下降到0.125 μg·mL-1。具體見表3。

3.3 頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯(lián)合應(yīng)用FIC指數(shù)分布

頭孢拉宗與阿米卡星聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)IC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占27.27%，F(xiàn)IC = 1占36.36%，1 ＜ FIC≤4占9.1%，F(xiàn)IC ＞ 4為0，說明頭孢拉宗與阿米卡星聯(lián)用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌多數(shù)以相加作用為主，無關(guān)較少，無拮抗作用；頭孢拉宗與異帕米星聯(lián)用時(shí)，F(xiàn)IC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占54.55%，F(xiàn)IC = 1占9.09%，1 ＜ FIC≤4占9.09%，F(xiàn)IC＞ 4為0，說明頭孢拉宗與異帕米星聯(lián)用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌以部分協(xié)同作用為主，相加和無關(guān)作用較少，無拮抗作用。具體見圖1。

表3 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯(lián)用對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的MIC值. n = 11，μg·mL-1Tab 3 The values of MICs of CBPZ alone or combined with AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

圖1 聯(lián)合抗菌藥物的FIC指數(shù)分布. n = 11Fig 1 The percent distribution of FIC of CBPZ and AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae. n = 11

3.4 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯(lián)用對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線

與單用相比，頭孢拉宗與阿米卡星和異帕米星聯(lián)用的累積抑菌百分率曲線明顯左移，表明在相同累積抑菌百分率下，兩藥聯(lián)合應(yīng)用比兩藥單獨(dú)應(yīng)用所需的藥物濃度低；在相同的給藥濃度下，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥具有更高的抗菌效應(yīng)。具體見圖2和圖3。

圖2 頭孢拉宗與阿米卡星單用和聯(lián)用對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線Fig 2 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with AMKC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

圖3 頭孢拉宗與異帕米星單用和聯(lián)用對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線Fig 3 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

4 討論

近年來，雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌不僅對除碳青霉烯類外的其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥率極高，對非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物如慶大霉素、阿米卡星和環(huán)丙沙星的耐藥性也顯著高于單純高產(chǎn)AmpC酶或單純產(chǎn)ESBLs的陰溝腸桿菌，其多重耐藥性非常嚴(yán)重。

頭孢拉宗是第三代頭霉素類抗菌藥物，抗菌譜有所擴(kuò)大，耐酶性強(qiáng)，對多種革蘭陰性菌具有較高的抗菌活性，特別是對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬和吲哚陽性變形桿菌有良好的抗菌力。其對革蘭陰性菌的體外抗菌活性大多優(yōu)于頭孢西丁、頭孢美唑等。頭孢拉宗對各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶極為穩(wěn)定，對β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌也有強(qiáng)大的抗菌作用。

異帕米星是慶大霉素B的1-N-HABA衍生物，具有與阿米卡星相似的抗菌活性，適用于治療對其他氨基糖苷類藥物、包括對阿米卡星耐藥的革蘭陰性桿菌（包括雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌）和葡萄球菌所致的嚴(yán)重感染[8-9]。異帕米星具有顯著的抗生素后效應(yīng)，維持并加強(qiáng)了氨基糖苷類藥物的優(yōu)勢，具有強(qiáng)效殺菌活性、致耐藥性低以及毒副作用小和具有良好的抗生素后效應(yīng)等特點(diǎn)，廣泛用于各類細(xì)菌感染的治療。

本研究對11株雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌的體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯(lián)用可顯著降低單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的MIC，聯(lián)合應(yīng)用后比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的濃度-累積抑菌百分率曲線明顯左移，效應(yīng)增強(qiáng)，以部分協(xié)同和相加作用為主,說明兩種藥物聯(lián)用對雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌具有較好的體外抗菌活性。因此，在治療由雙產(chǎn)酶陰溝腸桿菌導(dǎo)致的感染時(shí)，可以考慮采用頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯(lián)合應(yīng)用。

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