秦艽愈傷組織緩漫生長(zhǎng)保存及其生理指標(biāo)研究△

晉玲，張延紅，高素芳

（甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000）

秦艽愈傷組織緩漫生長(zhǎng)保存及其生理指標(biāo)研究△

晉玲*，張延紅，高素芳

（甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000）

目的：篩選秦艽愈傷組織緩慢生長(zhǎng)保存的適宜方法，進(jìn)一步研究保存后愈傷組織形態(tài)指標(biāo)與生理指標(biāo)之間的相關(guān)性。方法：向培養(yǎng)基中添加不同濃度生長(zhǎng)抑制劑、高滲化合物及不同基本培養(yǎng)基保存秦艽愈傷組織，在室溫下保存6個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。測(cè)定不同濃度甘露醇、矮壯素和蔗糖處理中秦艽愈傷組織的生理指標(biāo)。結(jié)果：1.0mg·L－1ABA和9％蔗糖處理中愈傷表面產(chǎn)生大量胚狀體，生長(zhǎng)良好。5％甘露醇和PEG處理中愈傷黃綠色，生長(zhǎng)良好。PP333中愈傷生長(zhǎng)一般，CCC中愈傷老化。9％蔗糖處理中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于其它濃度和甘露醇、矮壯素處理。結(jié)論：1.0mg·L－1ABA，9％蔗糖保存秦艽愈傷組織效果最好；5％甘露醇和PEG保存效果良好?？扇苄蕴?、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)3個(gè)生理指標(biāo)可以在一定程度上反映秦艽愈傷組織在延緩保存時(shí)的存活情況。

秦艽；愈傷組織；延緩生長(zhǎng)保存；形態(tài)學(xué)指標(biāo)；生理指標(biāo)

秦艽為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、麻花秦艽（G.straminea Maxim.）、粗莖秦艽（G.crassicaulis Duthie ex Burk.）和小秦艽（G.dahurica Fisch.）的干燥根，是中藥治療風(fēng)濕痹痛，關(guān)節(jié)病必不可少的藥物，但由于長(zhǎng)期以來(lái)過(guò)多強(qiáng)調(diào)開(kāi)發(fā)利用，盲目采挖，已使野生資源日趨減少，現(xiàn)已被列為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。因此，對(duì)其資源進(jìn)行保護(hù)具有十分重要的意義。最近幾十年中，以植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的緩慢生長(zhǎng)離體保存技術(shù)也得到了迅速發(fā)展，目前已成功地應(yīng)用于多種植物種質(zhì)資源的離體保存［1］。本試驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基上添加高滲化合物和生長(zhǎng)抑制劑對(duì)秦艽愈傷組織進(jìn)行離體保存，6個(gè)月后測(cè)定愈傷組織的形態(tài)和生理指標(biāo)，旨在篩選秦艽種質(zhì)資源中短期保存的適宜方法，深入研究這些物質(zhì)延緩衰老的生理機(jī)理。

1 材料及方法

1.1 材料

以秦艽種子發(fā)芽小苗的胚軸為外植體，接種在MS＋1.0mg·L－12，4-D＋0.5mg·L－16-BA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，在原培養(yǎng)基上6次繼代擴(kuò)繁后，獲得大量的愈傷組織做試材。

1.2 方法

1.2.1 本試驗(yàn)采用在愈傷繼代培養(yǎng)基上添加不同濃度生長(zhǎng)抑制劑：矮壯素（CCC）、脫落酸（ABA）、多效唑（PP333）；高滲化合物：蔗糖、甘露醇、聚乙二醇（PEG）及不同濃度基本培養(yǎng)基保存秦艽愈傷組織，在室溫下生長(zhǎng)6個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)愈傷量、愈傷質(zhì)地、顏色、分化情況、生長(zhǎng)情況。

1.2.1 將保存6個(gè)月的秦艽愈傷組織投入液氮速凍后置于－20℃冰箱中備用?？扇苄蕴呛偷矸酆繙y(cè)定采用蒽酮法，可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［2］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型和濃度的生長(zhǎng)抑制劑、高滲化合物及基本培養(yǎng)基對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響

2.1.1 不同類型和濃度的生長(zhǎng)抑制劑對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響 由表1可知，不同濃度CCC處理，愈傷組織增殖量均很大且分化出少量試管苗，但愈傷生長(zhǎng)不良，顏色褐色或暗黃綠，呈老化態(tài)。因此，CCC不適于秦艽愈傷組織延緩生長(zhǎng)保存。不同濃度PP333處理中，愈傷組織部分呈黃白色，部分褐化死亡。低濃度PP333中愈傷生長(zhǎng)情況好于高濃度，且產(chǎn)生少量胚狀體。高濃PP333中愈傷褐化嚴(yán)重，無(wú)分化。在1.0mg·L－1ABA處理中，愈傷呈黃色顆粒狀，有大量胚狀體產(chǎn)生，生長(zhǎng)良好，是一種有效的保存方法。

2.1.2 不同類型和濃度的高滲化合物對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響 在培養(yǎng)基中添加一些高滲化合物如蔗糖、甘露醇、山梨醇等也是一種常用的緩慢生長(zhǎng)保存手段，它們通過(guò)提高培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，降低細(xì)胞膨壓，使細(xì)胞吸水困難，同時(shí)細(xì)胞壁酶活性受到抑制，減弱新陳代謝活動(dòng)，延緩細(xì)胞生長(zhǎng)［3］。由表2可知，不同類型和濃度的高滲化合物保存秦艽愈傷效果的差異較大，在低濃度3％和6％蔗糖處理中，愈傷組織增殖量大，但愈傷老化，生長(zhǎng)不良。9％蔗糖處理中，愈傷增殖量少，呈黃色顆粒狀，并分化出大量胚狀體，生長(zhǎng)良好。因此，9％蔗糖處理可作為一種適宜的秦艽愈傷組織中短期保存的方法。在不同濃度甘露醇處理中，5％甘露醇愈傷增殖量不大，愈傷黃綠色，生長(zhǎng)良好，說(shuō)明該濃度保存效果良好。過(guò)高或過(guò)低濃度的甘露醇處理均不適于秦艽愈傷保存。PEG處理中愈傷組織呈黃綠色，增殖量較多，但生長(zhǎng)勢(shì)較好，保存效果良好。

表1 不同類型和濃度的生長(zhǎng)抑制劑對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響

表2 不同類型和濃度的高滲化合物對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響

2.1.3 不同濃度基本培養(yǎng)基對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響 從表3可以看出，不同濃度MS培養(yǎng)基保存效果均不良。愈傷組織呈褐色，死亡。因此，在室溫條件下，單純地增加或減少基本培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法達(dá)到保存的目的。要取得良好的保存效果，必須在培養(yǎng)基中附加高滲化合物或生長(zhǎng)抑制劑。

表3 不同濃度基本培養(yǎng)基對(duì)秦艽愈傷組織的形態(tài)學(xué)影響

2.2 不同種類和濃度的生長(zhǎng)抑制劑與高滲化合物對(duì)秦艽愈傷組織中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

從表 4得知，在 10mg·L－1、20mg·L－1與 50mg·L－1CCC處理中可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量之間差異不大，且很低。結(jié)合形態(tài)學(xué)指標(biāo)來(lái)看，3種濃度處理后愈傷組織均表現(xiàn)出老化衰亡跡象，在生理指標(biāo)上和形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)了一致性。

5％甘露醇處理的愈傷組織中可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)的含量均明顯高于2％和10％的甘露醇處理及矮壯素各濃度處理。而且從形態(tài)學(xué)指標(biāo)來(lái)看，5％甘露醇處理中愈傷生長(zhǎng)量少，呈現(xiàn)黃綠色，愈傷組織狀態(tài)良好，因此，可作為一種有效的秦艽愈傷延緩生長(zhǎng)的方法。與5％甘露醇處理相比，過(guò)低或過(guò)高濃度的甘露醇處理中愈傷組織保存效果都不良，且可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)的含量也均有所降低。

表4 不同濃度CCC、甘露醇和蔗糖處理中愈傷組織的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量

9％蔗糖處理中可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)的含量都明顯高于其它濃度處理，也高于5％甘露醇處理。從測(cè)得的形態(tài)指標(biāo)來(lái)看，9％蔗糖處理中的愈傷組織生長(zhǎng)量少，分化出大量黃色米粒狀的胚狀體，保存效果最好。4％和6％蔗糖處理中愈傷組織生長(zhǎng)量多，色澤暗淡，趨于老化，而且其可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的含量也較低。

因此，可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的含量在一定程度上可反映出愈傷組織的生長(zhǎng)情況。在高滲化合物處理時(shí)，植物細(xì)胞可能主要通過(guò)增加其體內(nèi)的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量來(lái)增強(qiáng)其在高滲環(huán)境中的生存能力。

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同類型和濃度的高滲化合物對(duì)秦艽愈傷組織保存效果的影響差異較大。9％蔗糖濃度處理中愈傷存活，增殖量不多，呈黃色顆粒狀，分化出大量胚狀體，且其可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的含量均高于其它處理，是秦艽延緩生長(zhǎng)保存的有效方法。

3.2 5％甘露醇處理中愈傷生長(zhǎng)良好，增殖量少，2％和10％甘露醇處理效果不佳，老化或死亡。同時(shí)生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，5％甘露醇處理的愈傷組織中可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)含量均高于2％和10％甘露醇處理。PEG處理下愈傷組織增殖量較多，呈黃綠色，生長(zhǎng)良好。1.0mg·L－1ABA處理中愈傷生長(zhǎng)良好，增殖量少，并分化出大量胚狀體。因此，以上幾種方法均可用作秦艽愈傷組織的中短期保存。

3.3 CCC處理中愈傷增殖量最大，但愈傷均老化，其可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)含量也較其它有效保存處理低。故CCC不適宜于秦艽愈傷組織延緩生長(zhǎng)保存。在室溫條件下，單純地增加或減少基本培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法達(dá)到中短期保存的目的。PP333的保存效果一般。

3.4 在逆境條件下（低溫，高溫，干旱等），有的植物對(duì)逆境具有適應(yīng)能力或抗性，有的植物對(duì)逆境較為敏感。當(dāng)脅迫超出了植物正常生長(zhǎng)、發(fā)育所能承受的范圍將導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的生理生化變化，如可溶性糖、淀粉含量、可溶性蛋白質(zhì)等，植物受到傷害甚至死亡［4］。本研究表明高滲化合物甘露醇和蔗糖處理時(shí)，秦艽組織可能通過(guò)提高體內(nèi)的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量來(lái)應(yīng)對(duì)高滲逆境。

3.5 不同的高滲化合物和生長(zhǎng)抑制劑，延緩生長(zhǎng)保存愈傷組織的策略不同，一種是誘導(dǎo)產(chǎn)生大量胚狀體，一種是形成大塊黃綠色或黃白色愈傷組織，其機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。有研究表明向培養(yǎng)基中添加ABA和高濃度的蔗糖，有利于胚狀體的誘導(dǎo)［5］，誘導(dǎo)獲得的胚狀體可較長(zhǎng)時(shí)間地處于休眠狀態(tài)。本研究也得到了類似的結(jié)果，9％蔗糖和1％ABA處理中均分化出大量黃色顆粒狀胚狀體。胚狀體像合子胚一樣處于休眠狀態(tài)，沒(méi)有萌發(fā)成苗，可能是一種良好的保存狀態(tài)，保存的時(shí)間更長(zhǎng)。將延緩生長(zhǎng)保存6個(gè)月的黃色顆粒狀胚狀體轉(zhuǎn)接在1/2MS培養(yǎng)基上，胚狀體的子葉轉(zhuǎn)綠，并開(kāi)始伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，試管苗形態(tài)正常。但柿的試管苗延緩生長(zhǎng)保存表明，ABA不太適宜于中短期保存［6］。因此，對(duì)于通過(guò)胚狀體發(fā)生途徑再生植株的藥用植物可以通過(guò)本研究篩選的方法嘗試保存植物材料。

3.6 在秦艽愈傷組織延緩生長(zhǎng)保存中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論哪種處理，同一瓶中的愈傷組織總會(huì)以犧牲極少部分愈傷為代價(jià)來(lái)保全多數(shù)愈傷的生存。這可能是延緩生長(zhǎng)保存的又一策略。

［1］張俊，蔣桂華，敬小莉，等.我國(guó)藥用植物種質(zhì)資源離體保存研究進(jìn)展［J］，世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（3）：556-560.

［2］張志良主編.植物生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］，北京：高等教育出版社，2009.

［3］陳輝，陳曉玲，陳龍清，等.百合種質(zhì)資源限制生長(zhǎng)法保存研究.園藝學(xué)報(bào)［J］，2006，33（4）：789-793.

［4］吳能表，吳俊巖，朱利泉，等.低溫對(duì)甘藍(lán)逆境生理指標(biāo)和蛋白質(zhì)磷酸化的影響［J］，園藝學(xué)報(bào)，2003，30（5）：530-534.

［5］王蒂主編.植物組織培養(yǎng)［M］，北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［6］艾鵬飛，羅正榮.柿和君遷子試管苗緩慢生長(zhǎng)法保存及其遺傳穩(wěn)定性研究［J］，園藝學(xué)報(bào)，2004，31（4）：441-446.

Studies on M ethod for the Callus of Gentiana macrophylla Pall.Slow ly Grow ing and Its Physiological Index

JIN Ling*，ZHANG Yan-hong，GAO Su-fang
（Department of Herbs，Gansu College of TCM，Lanzhou 730000，China）

Objective：An appropriate conservation method for callus of Gentiana macrophylla Pall.slowly growing，and the relationship of physiological index and morphological index of the conserved callus were studied.M ethods：To conserve callus，growth inhibitors and high permeability compounds were added to the medium，or different concentration of basic medium were used.After the callus was conserved for six month at room temperature，the morphological index was recorded and physiological index of the conserved callus of Gentiana macrophylla with different concentration ofmannitol，CCC and sucrose were measured.Results：A large number of embryoid were generated in the surface of callus with the treatment of 1.0mg/L ABA and 9％sucrose and grew well.The callus showed yellow-green and grew well under the treatmentwith 5％mannitol and PEG.Callus in PP333 grew commonly and callus in CCCwas aging.Under the treatmentwith 9％sucrose，soluble sugar，starch and soluble protein content were significantly higher than treated with the other concentration of sucrose，mannitol or CCC.Conclusion：The best condition for callus conservation of Gentiana macrophylla was 1.0mg/L ABA and 9％sucrose，followed by 5％mannitol and PEG.Soluble sugar，starch and soluble protein can partly reflect the survival rate of the callus conservation slowly growing.

Gentiana macrophylla Pall.；Callus；Slow growth conservation；Morphological index；Physiological index

2012-09-29）

甘肅省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（GZK-2012-Z2）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（04-C52L23）

*［通訊作者］晉玲，Tel：（0931）8765495，E-mail：zyxyjl＠163.com