伽馬射線體外照射對細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的殺滅作用

袁 慶，李 波，賀 凱，張孟瑜，多 吉，陳 川，李 興，向證文

棘球蚴?。╡chinococcosis）即包蟲病（hydatidosis），是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲（稱棘球蚴或包蟲）寄生于人或其他動物體內(nèi)引起。細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)（echinococcus protosclex）是人類包蟲病發(fā)病的一個中心環(huán)節(jié)，它即可在犬類腸道內(nèi)發(fā)育成成蟲通過有性繁殖，產(chǎn)生蟲卵，經(jīng)糞－口途徑感染人類。又可因棘球蚴病人術(shù)中囊液外溢或外傷導(dǎo)致棘球蚴破裂，原頭節(jié)在腹腔內(nèi)廣泛種植。由于目前沒有藥物能有效殺滅原頭節(jié)［1－5］，因 此 它 既 是 影 響 手 術(shù) 治 療 預(yù) 后 的 重 要 因素［6－8］，也 是 囊 性 包 蟲 病 預(yù) 防 和 研 究 的 重 要 一環(huán)［9－10］。本文擬在體外培養(yǎng)的條件下，用不同劑量的γ－射線對其進(jìn)行照射，探索伽馬射線治療包蟲病的可能性。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié) 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)在四川省人民醫(yī)院肝包蟲手術(shù)中采集完整包蟲囊腫，保存于4℃冰盒送入實(shí)驗(yàn)室。將肝包蟲囊腫置于超凈工作臺上消毒表面后，用50mL注射器穿刺抽取囊液，采取反復(fù)吹打法，確保依附于內(nèi)囊壁的原頭節(jié)完全被采集。抽凈囊液后剪開囊壁，用生理鹽水沖洗內(nèi)囊表面，將沖洗液與囊液一同收集備用。用離心機(jī)以3 000r／min×5min得到黃白色囊砂，倒去上清液后用沖洗液，沖洗3次。向囊砂內(nèi)滴加20%胰蛋白酶溶液1mL，靜置20min以融化其中的組織碎屑，獲得的原頭節(jié)懸液備用。

1．1．2 試劑 ①RPMI－1640培養(yǎng)液：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；②胎牛血清：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；③青－鏈霉素溶液：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；④美蘭溶液：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；⑤胰蛋白酶溶液：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；⑥caspase－3蛋白酶檢測試劑盒：⑦廣州健侖生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 原頭節(jié)的孵育 原頭節(jié)懸液內(nèi)加入10mL RPMI－1640培養(yǎng)液，取0．2mL溶液滴在載玻片上置于倒置顯微鏡下以計數(shù)后，加入20%美蘭溶液，觀察原頭節(jié)的存活率。將原頭節(jié)以2 000個／mL的密度培養(yǎng)于含20%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

1．2．2 γ－射線照射 孵育的原頭節(jié)出現(xiàn)頭節(jié)外翻現(xiàn)象時，進(jìn)行γ－射線殺傷試驗(yàn)。將原頭節(jié)培養(yǎng)液混勻后平均分裝入11個培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分組。其中1組作為對照組，另外10組作為實(shí)驗(yàn)組，置于鈷－60治療儀下進(jìn)行照射。實(shí)驗(yàn)組γ－射線照射劑量分別為10Gy、20Gy、40Gy、60Gy、80Gy、100Gy、120 Gy、140Gy、160Gy和180Gy。

1．2．3 觀察原頭節(jié)的死亡率 γ－射線照射后每天用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，選擇10個視野，根據(jù)其總數(shù)計算原頭節(jié)死亡率，死亡率＝（死亡的原頭節(jié)／原頭節(jié)總數(shù)）×100%，連續(xù)觀察直到全部實(shí)驗(yàn)組中的原頭節(jié)全部死亡為止。

1．2．4 檢測原頭節(jié)內(nèi)caspase－3蛋白活性 γ－射線照射后第12h從每組含原頭節(jié)的培養(yǎng)液中各收集1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行caspase－3蛋白活性的檢測，4℃下將各組含原頭節(jié)的培養(yǎng)液在3 000r／min×5min后，小心吸出上清液，確保沒有吸出原頭節(jié)，用PBS緩沖液洗滌，加入1μL裂解液，0℃下混勻后裂解15min。4℃離心3 000r／min×10min，去除上清液。加入caspase－3底物（Ac－DEVD－pNA）各10μL 混勻，37℃避光孵育2h，轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板在405 nm波長處用酶標(biāo)儀測定caspase－3底物被蛋白酶分解產(chǎn)物的吸光值。

1．2．5 觀察原頭節(jié)顯微結(jié)構(gòu)的變化 在γ－射線照射原頭節(jié)后第1天開始利用倒置顯微鏡動態(tài)觀察并全程記錄原頭節(jié)從照射到死亡時間段內(nèi)結(jié)構(gòu)的的變化情況。

1．3 統(tǒng)計分析方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計包，應(yīng)用趨勢χ2檢驗(yàn)對每日各組原頭節(jié)死亡率進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05；應(yīng)用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)對各組原頭節(jié)細(xì)胞caspase－3蛋白活性檢測值進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié) 果

2．1 原頭節(jié)孵育 共收集到囊液及沖洗液300 mL。經(jīng)過處理后美籃染色計數(shù)確定原頭節(jié)存活率為96．5%，原頭節(jié)總數(shù)約1．5×105～1．6×105個。在體外孵育過程中原頭節(jié)活動活躍（圖1），到第3d時原頭節(jié)出現(xiàn)外翻現(xiàn)象。

2．2 γ－射線對原頭節(jié)的殺滅情況 在經(jīng)過γ－射線照射后，100Gy～180Gy的劑量導(dǎo)致原頭節(jié)出現(xiàn)急性殺傷作用，于2～4d內(nèi)全部死亡，40Gy～80Gy的劑量在第7d全部死亡，10Gy～20Gy的劑量于9～10d全部死亡原頭節(jié)中位生存時間的分析中可以看到隨著照射劑量的增加原頭節(jié)中位生存時間逐漸縮短（表1，圖2）。

表1 各組原頭節(jié)中位生存時間Tab．1 Median survival time of protoscoleces in each group

2．3 比較各劑量組之間原頭節(jié)每日死亡率之間的差別 每日各組原頭節(jié)死亡率進(jìn)行趨勢χ2檢驗(yàn)（表2）發(fā)現(xiàn)：隨著照射劑量的升高原頭節(jié)的死亡率增加，其P＜0．01。

2．4 原頭節(jié)細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白酶活性的變化在對各組原頭節(jié)細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白酶值（表3）行spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)rs＝0．986，P＜0．001，按α＝0．05水準(zhǔn)，可以認(rèn)為原頭節(jié)細(xì)胞內(nèi)caspase－3蛋白酶值與放射劑量有正相關(guān)關(guān)系。

表2 每日各組原頭節(jié)死亡率趨勢χ檢驗(yàn)情況Tab．2 Daily tendency of the death incidence of protoscoleces in each group indicated byχ2 test

2．5 照射后原頭節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變 γ－射線照射后原頭節(jié)出現(xiàn)3個階段的變化，第1階段：原頭節(jié)整體形態(tài)出現(xiàn)腫脹，由最初的橢圓形變化為球形，鈣顆粒之間的距離延長，原頭節(jié)有所增大，活動度明顯減弱，頭節(jié)外翻幾乎停止；第2階段：原頭節(jié)整體形態(tài)出現(xiàn)塌陷，邊界出現(xiàn)模糊，小鉤脫落，原頭節(jié)內(nèi)顏色渾濁，有褐色顆粒樣物質(zhì)沉著，活動度進(jìn)一步減弱；第3階段：原頭節(jié)整體結(jié)構(gòu)破碎（圖3）。

圖1 原頭節(jié)活動造成身后形成拖拽痕跡（箭頭）（×100）Fig．1 Formation of the drag traces after the protoscoleces activities（indicated by the arrow）（×100）

圖2 原頭節(jié)經(jīng)不同劑量γ－射線照射后的生存曲線Fig．2 Survival curves for protoscoleces treated with different doses of gamma－ray irradiation

圖3 原頭節(jié)受到γ－射線照射后的變化（×400）A、為照射前原頭節(jié)結(jié)構(gòu)完整，口器、吸盤結(jié)構(gòu)清晰；B為第一階段：原頭節(jié)整體形態(tài)出現(xiàn)腫脹，C為第二階段：原頭節(jié)整體形態(tài)出現(xiàn)塌陷，邊界出現(xiàn)模糊，小鉤脫落，原頭節(jié)內(nèi)顏色渾濁，有褐色顆粒樣物質(zhì)沉著，活動度進(jìn)一步減弱；D為第三階段：原頭節(jié)整體結(jié)構(gòu)破碎。Fig．3 Changes of protoscoleces after the gamma－ray irradiation（× 400）A：Structural integrity of protoscoleces before irradiation，and the clear structure of the mouthparts and the suction cup；B：The first phase－the overall morphology of protoscoleces swells；C：The second stage－the overall morphology of protoscoleces begins to collapse，the border becomes fuzzy，a small hook falls off，the inside color of protoscoleces becomes muddy，brown granular substance appears，and activity further weakens；D：The third stage－the overall structure of protoscoleces breaks up．

3 討 論

60鈷源發(fā)射的γ－射線作為一種常用的電離輻射治療措施具有：穿透力強(qiáng)對皮膚有保護(hù)作用骨組織吸收劑量小全身反應(yīng)小，安全性高、經(jīng)濟(jì)可靠的物理特性。已廣泛用于顱腦腫瘤、腦血管畸形、肺癌、肝癌等實(shí)質(zhì)臟器及膀胱癌、胃癌、直腸癌等空腔臟器疾病的治療。其作用機(jī)制在于可直接引發(fā)生物活性大分子發(fā)生電離、激發(fā)、化學(xué)鍵斷裂，破壞其分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能；并引起水分子的電離和激發(fā)，形成高毒、高氧化性的各種自由基，使生物大分子損傷，誘發(fā)細(xì)胞壞死或凋亡。γ－射線一次窄束大劑量照射后靶組織的損傷與修復(fù)可以分為3期：第一期 壞死期 靶點(diǎn)中心呈急性水腫及炎癥反應(yīng)；第二期 吸收期 自壞死后壞死灶的大量細(xì)胞碎片已被吸收，膠質(zhì)細(xì)胞修補(bǔ)、填充，形成瘢痕；第三期 一些早期變化如炎癥反應(yīng)已消失，細(xì)胞碎片被清除，血管減少，巨核細(xì)胞消失，膠質(zhì)瘢痕形成，提示不可逆性結(jié)構(gòu)性改變。

電離輻射誘發(fā)細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)過程。電離輻射可激活caspase－3，或活化其前體而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［11］。半胱氨酸蛋白酶（Cysteine requiring Aspartate protease；caspase）或稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶。它們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基的肽鍵。caspase負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細(xì)胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶－3（caspase－3）是半胱氨酸蛋白酶家族中 CED－3（Cell Death Gene Number 3）分支中的一種，又稱半胱氨酸蛋 白 酶－32CPP32（Cysteine Proteinase Protein 32kd）。它在細(xì)胞凋亡效應(yīng)階段起著核心作用［12－13］。目 前 已 證 實(shí) 原 頭 節(jié) 細(xì) 胞 存 在 著 凋 亡 現(xiàn)象［14］，而 caspase－3 參 與 了 原 頭 節(jié) 細(xì) 胞 的 凋 亡［15］。在本實(shí)驗(yàn)組原頭節(jié)細(xì)胞中caspase－3蛋白酶活性和γ－射線劑量之間存在著量效關(guān)系，不僅證明caspase－3參與了原頭節(jié)細(xì)胞的凋亡，也說明原頭節(jié)細(xì)胞是γ－射線誘導(dǎo)凋亡的敏感細(xì)胞。

相比細(xì)胞凋亡，細(xì)胞壞死的機(jī)理與之有本質(zhì)的差別。細(xì)胞壞死是在某種強(qiáng)烈刺激條件下發(fā)生的一種被動死亡，電離輻射由于基因毒性，在超過一定劑量后可以直接導(dǎo)致細(xì)胞壞死。細(xì)胞壞死前可發(fā)生代謝中止和ATP消耗造成細(xì)胞膜鈉－鉀離子泵抑制［16］，細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器腫脹變大，最后細(xì)胞破裂。薛麗香等［17］認(rèn)為電離輻射后出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡與壞死是電離輻射的直接作用所致，即電離輻射通過損傷DNA啟動了細(xì)胞的凋亡發(fā)生；而電離輻射對細(xì)胞能量代謝的影響以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與遺傳物質(zhì)的損傷，加之細(xì)胞凋亡后的繼發(fā)性壞死，則是導(dǎo)致細(xì)胞壞死的原因。據(jù)此分析，在本實(shí)驗(yàn)中γ－射線照射后原頭節(jié)出現(xiàn)腫脹—塌陷—碎裂，并隨照射劑量的增大會更加明顯的現(xiàn)象。其原因就在于輻射造成了原頭節(jié)細(xì)胞的壞死，這也與γ－射線照射后靶組織出現(xiàn)的壞死、吸收期表現(xiàn)類似。

綜上所述，我們初步判斷γ－射線照射可激活原頭節(jié)細(xì)胞caspase－3蛋白酶從而誘發(fā)其凋亡，同時由于其基因毒性造成了原頭節(jié)細(xì)胞的壞死。在γ－射線對原頭節(jié)細(xì)胞同時造成的主動死亡和被動死亡的作用下，直接的結(jié)果就是原頭節(jié)的死亡。

目前國內(nèi)外對于棘球蚴病的治療方式主要包括手術(shù)治療和藥物治療兩種形式，但是手術(shù)治療后出現(xiàn)殘腔感染、殘腔出血、殘腔膽汁漏、鈣化殘腔不閉合、術(shù)后黃疸、過敏性休克、殘腔原位復(fù)發(fā)等并發(fā)癥，發(fā)生率可達(dá)到10．8%～65．8%［18］以阿苯達(dá)唑?yàn)榇淼乃幬镏委熤?，不論是阿苯達(dá)唑還是其脂質(zhì)體其治愈率僅為30%左右［19］。棘球蚴病治療中一個重要的難點(diǎn)就在于沒有一種確實(shí)有效的方法殺滅體內(nèi)的原頭節(jié)。在經(jīng)過本次試驗(yàn)后，可以認(rèn)為γ－射線體外照射可以誘導(dǎo)原頭節(jié)細(xì)胞凋亡，造成原頭節(jié)細(xì)胞壞死，并殺滅原頭節(jié)。相信γ－射線將會成為一種治療細(xì)粒棘球蚴的新手段。有關(guān)γ－射線治療棘球蚴病的適合劑量尚需要進(jìn)一步的研究。

［1］Bao GS．In vitro observation on albendazole sulfoxide and its enantiomers against Echinococcus granulosus protoscolex［J］．Chin J Parasitol Parasit Dis，2008，26（6）：459－461．（in Chinese）包根書．阿苯達(dá)唑亞砜及其對映體體外抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴作用［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008，26（6）：459－461．

［2］Kang JF，Hu HH，Baishan BK，etal．In vitro observation on the apoptosis induced by hydrogen peroxide in protoscolex of E－chinococcus granulosus［J］．Chin J Parasitol Parasit Dis，2008，26（5）：332－337．（in Chinese）康金風(fēng)，胡漢華，白山別克，等．過氧化氫體外誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008，26（5）：332－337．

［3］Lv HL，Peng XY，Zhang SJ，etal．Effect of the liposome albendazole and Huai－Er fungus extract on hepatic infestation of Echinococcus granulosus in mice［J］．Chin J Parasitol Parasit Dis，2008，26（5）：361－365．（in Chinese）呂海龍，彭心宇，張士杰，等．阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體及槐耳浸膏對小鼠肝細(xì)粒棘球蚴感染率影響的實(shí)驗(yàn)觀察［J］．中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008，26（5）：361－365．

［4］Adas G，Arikan S，Kemik O，etal．Use of albendazole sulfoxide，albendazole Sulfone，and combined solutions as scolicidal agents on hydatidcysts （in vitro study）［J］．World J Gastroenterol，2009，15（1）：112－116．

［5］Jiang S，Jia B，Chen LX，etal．Comparative observation on pathology of albendazole and its liposomes treating hepatic hydatidosis of sheep［J］．Heilongjiang Anim Sci Vet Med，2009，10（1）：82－83．（in Chinese）蔣松，賈斌，陳玲香．阿苯達(dá)唑及其脂質(zhì)體治療羊肝包蟲病的病理學(xué)比較觀察［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009，10（1）：82－83．

［6］Lv X，Li XS．Current conditions and prospects of laparoscopic treatment of hepatic hydatid cysts［J］．Chin J Laparoscopic Surg，2010，3（1）：36－37．（in Chinese）呂西，李徐生．腹腔鏡治療肝包蟲的現(xiàn)狀及展望［J］．中華腹腔鏡外科雜志，2010，3（1）：36－37．

［7］Gollackner B，Langle F，Aner H，etal．Radical surgical therapy of abdominal cystic hydatid disease［J］．Factors Recurrence，2000，24（3）：717－721．

［8］Uhl WLoftier HZimmer mann Aetal．Surgical treatment of echinococcosis ofthe liver［J］．Swiss Surg，1999，5（1）：126－132．

［9］Colebrook AL，Jenkins DJ，Jones MK，etal．Effect of cyclosporin A on the survival and ultrastructure of Echinococcus granulosus protoscoleces invitro［J］．Parasitology，2004，129（4）：497－504．

［10］Puryan K，Karadayi K，Topcu O，et a1．Chlorhexidine gluconate：an ideal seolicidal agent in the treatment of intraperitoneal hydatidosis［J］．World J Surg，2005，29（2）：227－230．

［11］Yuan J，Shaham S，Le doux S，etal．The C．elegans cell death gene ced－3encodes a protein similar to mammalin interleukin Ibeta converting enzyme［J］．Cell，1993，75（4）：641－652．

［12］Liu XY，Liu JJ．Caspas and apoptosis［J］．Med J Wuhan Univ，2004，25（6）：742－744．（in Chinese）劉曉翌，劉建軍．Caspase與細(xì)胞凋亡［J］．武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2004，25（6）：742－744．

［13］Chu GM．Activation routes and regulation mechanism of Caspase［J］．Shaanxi Med J，2004，33（9）：809－811．（in Chinese）楚廣民．Caspase激活途徑及調(diào)控機(jī)制［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2004，33（9）：809－811．

［14］Wang X，Wang XH，Bao GS，etal．Experimental study on radiation therapy for hydatidosis［J］．Chin J Zoonoses，2009，25（7）：653－656．（in Chinese）王欣，王小虎，包根書，等．放射線治療包蟲病的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2009，25（7）：653－656．

［15］Hu HHKang JFChen Retal．Effect of cell caspase－3expression and ultrastructure of Echinococcus granulosus protoscolex induced by hydrogen peroxide in vitro［J］．Chin J Zoonoses，2009，25（4）：318－321．（in Chinese）胡漢華，康金鳳，陳蓉，等．過氧化氫體外誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)細(xì)胞caspase－3表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響［J］．中國人獸共患病學(xué)報，2009，25（4）：318－321．

［16］Majno G，Joris I．Apoptosis，oncosis，and necrosis．An overview of cell death［J］．Am J Pathol，1995，146（1）：3－15．

［17］Xue LX，Jin GH，F(xiàn)u SB，etal．Effect of ionizing radiation on EL－4apoptosis and necrocytosis［J］．Chin J Radiol Med Prot，2001，21（1）：24－26．（in Chinese）薛麗香，金光輝，付士波，等．電離輻射對EL－4細(xì)胞凋亡與壞死的影響［J］．中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2001，21（1）：24－26．

［18］Peng XY．Surgery complications of hepatic hydatid cysts［M］．Beijing：People’s Health Publishing House，2000：439－651．（in Chinese）彭小宇．肝包蟲的外科手術(shù)并發(fā)癥［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：439－651．

［19］Li HT，Ke S，Wen H，etal．Observation on efficiency of human hydatidosis treated by liposomal albendazole in 66cases［J］．Endem Dis Bull，2004，19（1）：16－19．（in Chinese）李海濤，柯山，溫浩，等．阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體治療66例人體包蟲病的療效觀察［J］．地方病通報，2004，19（1）：16－19．