紅外及近紅外光譜法對真?zhèn)锡堼X的快速鑒別△

黃必勝，袁明洋，余馳，陳科力*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)&教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點實驗室，湖北 武漢 430065； 2.仙桃市藥品檢驗所，湖北 仙桃 433000)

紅外及近紅外光譜法對真?zhèn)锡堼X的快速鑒別△

黃必勝1，袁明洋1，余馳2，陳科力1*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)&教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點實驗室，湖北 武漢 430065； 2.仙桃市藥品檢驗所，湖北 仙桃 433000)

目的：建立近紅外光譜對真?zhèn)锡堼X的快速識別方法。方法：采用近紅外光譜法對真?zhèn)锡堼X進(jìn)行化學(xué)成分分析，在此基礎(chǔ)上探索建立近紅外光譜聚類分析模型，并驗證模型的準(zhǔn)確性。結(jié)果：在紅外光譜區(qū)真?zhèn)锡堼X都有其特征吸收峰，且偽品龍齒具有更多的峰信息；在此基礎(chǔ)上成功建立了近紅外光譜聚類分析模型。結(jié)論：紅外光譜法可以作為驗證龍齒化學(xué)成分的一種方法，而利用近紅外光譜法建立相應(yīng)的模型可以快速準(zhǔn)確地鑒別真?zhèn)锡堼X。

龍齒；紅外光譜；近紅光譜法；聚類分析

中藥龍齒為古代哺乳動物牙齒的化石，隨著其資源的日益減少和價格的提高，其混偽品也日漸增多。如：將?；蚱渌溉閯游锏难例X經(jīng)石灰窖埋后，再打碎成細(xì)小碎塊或粉末后充“白龍齒”出售[1]。其外觀性狀與正品大致相同，外觀類似，不易區(qū)別，而以性狀鑒別為基礎(chǔ)的經(jīng)驗鑒別因主觀性較強(qiáng)很難快速準(zhǔn)確鑒別其真?zhèn)危虼颂剿鞑捎弥屑t外光譜對真?zhèn)锡堼X進(jìn)行鑒別。近年來，利用近紅外光譜法鑒別中藥材真?zhèn)蔚难芯吭絹碓蕉郲2-6]，而對中藥龍齒真?zhèn)舞b別尚無。筆者嘗試?yán)媒t光譜法對真?zhèn)锡堼X進(jìn)行快速分析研究，并建立相應(yīng)的定性模型，所建立的聚類分析模型可以快速鑒別真?zhèn)锡堼X。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectrum 400傅立葉變換紅外光譜儀，測定范圍：4 000～400 cm-1，車載近紅外光譜儀(MATRIX-F型，外接1.5 m固體光纖探頭)，OPUS工作站。

1.2 材料

23批樣品分別采自于湖北中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館、安徽亳州中藥材市場、河北安國中藥材市場、河南禹州中藥材市場、湖南廉橋中藥材市場以及湖南花板橋中藥材市場。每批樣品均經(jīng)過湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室陳科力教授鑒定。

溴化鉀(KBr)(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 中紅外光譜分析

取龍齒原藥材洗凈，晾干，砸成小塊，粉碎過200目篩備用。分別將樣品粉末和磨細(xì)的溴化鉀按1∶100的比例在瑪瑙研缽中混合均勻，在手動壓片機(jī)上制成透明薄片進(jìn)行測試。測定區(qū)域4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)16次，分辨率4 cm-1，數(shù)據(jù)處理圖譜經(jīng)計算機(jī)自動基線校正和自動縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化處理。對比真?zhèn)锡堼X的紅外吸收圖譜，如圖1，發(fā)現(xiàn)二者有相似之處。由于龍齒的主要成分為碳酸鈣和磷酸鈣[7]，從其紅外吸收光譜可以觀察到磷酸鈣的特征吸收峰1 033，957，602，565，470 cm-1，其中1 033 cm-1為PO42-反對稱伸縮振動，957 cm-1為PO42-對稱伸縮振動，602、565 cm-1為PO42-不對稱變角振動，470 cm-1為PO42-對稱變角振動。CO32-的4個原子處于同一平面內(nèi)，3個氧原子在正三角形的3個頂點。CO32-有4種振動模式，分別是反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動、面外彎曲振動、面內(nèi)彎曲振動。CO32-所對應(yīng)的紅外吸收峰位置分別處于以下4個窄帶之內(nèi)：1 510～1 390 cm-1，1 120～1 045 cm-1，885～820 cm-1，775～680 cm-1。圖1中對應(yīng)的CO32-吸收峰為1 452，1 423，1 033，863，711 cm-1，其中CO32-反對稱伸縮振動對應(yīng)1 452，1 423 cm-1雙峰，1 033 cm-1本該為弱峰，該處有PO42-反對稱伸縮振動的貢獻(xiàn)，故為強(qiáng)峰。3 443 cm-1處為O-H伸縮振動吸收峰，因龍齒中還含有甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸等7種氨基酸[8]；1 636 cm-1可能為酰胺基中的羰基吸收峰。

從峰位上看，圖1所示的真?zhèn)锡堼X紅外光譜在峰數(shù)和形狀上幾乎一致，但在820～660 cm-1區(qū)域二者的圖譜存在著微小差異，偽品龍齒含有更多的峰信號。結(jié)果表明：在紅外光譜吸收范圍內(nèi)，偽品龍齒較正品龍齒含有更多的物質(zhì)信息。

圖1 真?zhèn)锡堼X紅外光譜圖

2.2 近紅外光譜分析

2.2.1 近紅外光譜的采集 所采集的樣品多來源于國內(nèi)流通量較大的中藥材專業(yè)市場內(nèi)主營礦物類藥材店面，樣品具有一定的地域代表性。對龍齒藥材樣品進(jìn)行光譜采集前應(yīng)該仔細(xì)觀察采集面的物理特征，排除樣品表面可能混有其他無機(jī)雜質(zhì)部位，以免影響樣品蘊含的真實光譜信息；其次，龍齒藥材外部棱角分明，在進(jìn)行近紅外掃描時，應(yīng)選擇平整部分，使光纖探頭與樣品貼合緊密，減少光的散射；另外，樣品內(nèi)的化學(xué)成分分布可能不一致，采集光譜時應(yīng)分次對藥材的各個面進(jìn)行掃描，保證樣品數(shù)據(jù)的完整性。同時將藥材粉碎，混合均勻后，對其粉末進(jìn)行光譜采集。

光譜采集參數(shù)：掃描波數(shù)間隔為8 cm-1，掃描累積32次，掃描區(qū)間為12 000～4 000 cm-1，InGaAs檢測器，光纖傳導(dǎo)。每份藥材樣品各面掃描共10次，藥材粉末重復(fù)掃描10次。龍齒原藥材及藥材粉末近紅外圖譜見圖2。

圖2 龍齒原藥材及粉末近紅外光譜圖

由圖2可以看出，龍齒藥材粉末的10張近紅外光譜重合在一起，光譜之間的差異性很??；而龍齒原藥材不同部位掃描得到的10張近紅外光譜各有差異，各個光譜不僅在吸光度上有差別，在峰形上也千差萬別。因此將原藥材不同面采集的圖譜與原藥材粉末的圖譜結(jié)合起來共同建立定性模型，既增大了藥材的信息量，又加強(qiáng)了模型的適用性。

2.2.2 真?zhèn)锡堼X近紅外光譜聚類分析定性模型的建立 從23批次樣品中隨機(jī)挑選11批樣品，編號為LQ-004號樣品藥材采集光譜后，將其粉碎制成編號為LQ-004-1號樣品，故訓(xùn)練集樣品共12批次，其余12批次為驗證集樣品。訓(xùn)練集樣品信息見表1，驗證集樣品信息見表2。

表1 真?zhèn)锡堼X訓(xùn)練集樣品信息

表2 真?zhèn)锡堼X驗證集樣品信息

對上述樣品的光譜圖進(jìn)行仔細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)所有樣品的近紅外光譜整體上較為相似，經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)處理后，光譜差異變得明顯，樣品的近紅外漫反射原始光譜和一階導(dǎo)數(shù)光譜見圖3。

圖3 真?zhèn)锡堼X的近紅外原始光譜及一階導(dǎo)數(shù)光譜

從樣品原始圖譜可以觀察到龍齒及其偽品在9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-13個波長區(qū)域內(nèi)光譜信號稍有不同，光譜經(jīng)過一階導(dǎo)數(shù)處理后，上述區(qū)域光譜差異更加明顯。由于建模樣品涉及到原藥材(塊狀)與藥材粉末，樣品的徑粒對近紅外光譜具有明顯的影響[9]，而矢量歸一化法可以消除徑粒對光譜的影響，因此采用矢量歸一化方法對圖譜進(jìn)行預(yù)處理是必要的。OPUS軟件可以對圖譜進(jìn)行預(yù)處理，通過考察一階導(dǎo)數(shù)、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化、二階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化4種預(yù)處理方法進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)利用一階導(dǎo)數(shù)和一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化預(yù)處理圖譜進(jìn)行聚類分析可以準(zhǔn)確將真?zhèn)锡堼X區(qū)別開。為了增加模型的適用性，消除樣品徑粒對光譜的影響，我們選擇預(yù)處理方法為：一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化。預(yù)處理方法中還包含有平滑點數(shù)的選擇，平滑可以消除誤差、改進(jìn)數(shù)據(jù)，在本模型中選擇5、9、13點平滑均未對聚類分析結(jié)果產(chǎn)生影響，但是平滑點數(shù)過多，會使數(shù)據(jù)失真，所以選擇9點平滑。波段范圍：9 000～8 000 cm-1，7 000～5 600 cm-1，4 800～4 000 cm-1，采用Ward’s algorithm(標(biāo)準(zhǔn)算法)計算，真?zhèn)锡堼X聚類分析圖見圖4。

由圖4可以看出，龍齒真品和偽品各聚為一類。在樹狀圖的左支(A)中，LQ-004-1、AG-017、YZ-022、AG-023、HBQ-002和BZD-002號樣品各自的10張光譜最先聚為一類，而其他6批樣品各自的10張光譜聚類較分散，說明龍齒藥材不同部位的化學(xué)成分可能有一定差異，藥材表面物理性質(zhì)的差異也會對光譜產(chǎn)生影響；而藥材粉碎成粉末后，其化學(xué)成分分布較均勻，故光譜的距離較小。另外LQ-004號樣品的10張光譜與其他正品樣品聚類，而與LQ-004-1號樣品聚類的僅有1張光譜，提示藥材經(jīng)過粉碎后其光譜會較原藥材發(fā)生變化，可能是徑粒等物理因素的影響或者是原藥材中的化學(xué)成分重新分布。在樹狀圖的右支(B)，LQ-006、BZC-043和ZY-035的圖譜在各小分支中聚集比較緊密，說明實驗的3批龍齒藥材偽品的化學(xué)成分較為接近，可能為同一種摻偽方式。從上述聚類分析圖譜可以明顯觀察到真?zhèn)锡堼X之間的區(qū)別，因此利用近紅外聚類分析法可以快速準(zhǔn)確地鑒別真?zhèn)锡堼X。

2.2.3 模型的驗證 將驗證集的11批樣品110張光譜帶入到已建好的真?zhèn)锡堼X定性模型中，對所有圖譜的正確識別率為72%，假陽性率為19%，如果以每一批樣品中的10張圖譜中的6張或以上被正確識別，則認(rèn)為對這一批樣品鑒別正確，那模型的識別率為82%。通過對上述模型的驗證，我們建立的龍齒近紅外定性鑒別模型基本能快速準(zhǔn)確地鑒別真?zhèn)锡堼X。

3 討論

龍齒為古代哺乳動物牙齒的化石，它們早期最原始的形態(tài)是動物的牙齒，牙齒因為有機(jī)質(zhì)較少，無機(jī)質(zhì)較多，故能保存較長的時間。牙齒被泥沙掩埋后地下水將過剩的礦物質(zhì)沉淀下來或成為晶體，隨著水流會逐漸滲進(jìn)泥沙中，填補(bǔ)牙齒有機(jī)質(zhì)腐爛后留下的空間，天長日久，原來的牙齒變成了還保存牙齒原有外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的石頭。而從國內(nèi)大型專業(yè)中藥材市場采集的龍齒偽品，經(jīng)陳科力教授鑒定為大型動物的牙齒，經(jīng)酸腐蝕和土埋處理后，作為龍齒銷售。因此用中紅外光譜法分析真?zhèn)锡堼X時，龍齒偽品含有較多的峰信息，可能為大型動物牙齒中少量的有機(jī)物特征信息。

在聚類分析模型中，發(fā)現(xiàn)各批龍齒原藥材的10張近紅外光譜在小類上相互聚集，藥材粉末的10張光譜都能緊緊地聚在一起。同一批龍齒的原藥材光譜只有部分光譜與其粉末的10張光譜聚為一類，可能的原因在于龍齒原藥材表面的化學(xué)成分分布不均勻。如：龍齒表面的琺瑯質(zhì)和龍齒橫斷面，在同一藥材不同面采集的10張近紅外光譜分別包含著相同或不同的化學(xué)信息，因此影響了模型的正確率。另外，各批次間的龍齒正品或龍齒偽品的化學(xué)信息也會有所不同，這也可能影響近紅外聚類分析模型的正確率。

近紅外光譜技術(shù)具有快速、無損分析的特點，實驗利用近紅外光譜聚類分析法對真?zhèn)锡堼X定性鑒別，結(jié)果表明從龍齒藥材各部位采集的光譜信息有所差異，藥材粉末光譜信息重復(fù)性較好，利用近紅外光譜聚類分析法可以快速準(zhǔn)確鑒別龍齒真?zhèn)纹贰?/p>

實驗中用于建立近紅外定性模型的樣品數(shù)量有限，不能涵蓋所有真?zhèn)锡堼X的信息，這對模型的適用性有一定的影響，采集到一定數(shù)量的樣品后，可以利用近紅外光譜技術(shù)建立相應(yīng)的定性模型，達(dá)到快速準(zhǔn)確鑒別的目的。

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IRSpectroscopicandNear-infraredSpectroscopicMethodforRapidIdentificationofDensDraconisanditsCounterfeit

HUANG Bi-sheng1，YUAN Ming-yang1，YU Chi2，CHEN Ke-li1*

(1.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResourceandCompoundPrescription，HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Wuhan430065,China；2.TheXiantaoInstituteforDrugControl，Xiantao433000,China)

Objective：To establish a rapid near-infrared spectroscopy identification method for Dens Draconis and its adulterants.Methods：Analyzed the Chemical composition of Dens Draconis and its adulterant by IR，established near-infrared spectral clustering analysis model.The accuracy of the model was verified.Results：Dens Draconis and its adulterant had different characteristic absorption peaks in the infrared spectral region，and the adulterants had more peaks information.On this basis，the near-infrared spectral clustering model was established successfully.Conclusion：IR is suitable to verify chemical composition of Dens Draconis.Dens Draconis and its adulterants could be quickly and accurately identified by the near-infrared spectral clustering analysis model.

Dens Draconis；IR spectroscopy；Near-infrared spectroscopy；Clustering analysis

2013-04-18)

武漢市2012年高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展行動計劃——生物技術(shù)與新醫(yī)藥專項(201260523193)

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陳科力，教授，研究方向：中藥資源及其品質(zhì)研究;E-mail：kelichen@126.com