培養(yǎng)基中不同碳源、激素對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長的影響

張春梅，陳杰昌，張喜軍

披針葉黃華（Thermopsis lanceolate）別名叫牧馬豆或野決明，多年生草本，全世界約有30種，我國有8種及3變種，主要分布于東北、華北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏、青海、新疆、四川等地區(qū)，俄羅斯、蒙古也有分布。生于河岸草地、沙丘、林下灌叢中以及田邊、路邊，偶進(jìn)入農(nóng)田［1］。全草藥用，能去痰，止咳，有興奮呼吸，升高血壓的功效，主治祛痰止咳［2］。其毒性為全草有毒，產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)興奮和氣官刺激癥狀［3］。在藥學(xué)上，傳統(tǒng)日用化工及精細(xì)化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有極好的開發(fā)利用價(jià)值。通過植物組織培養(yǎng)方法快速繁殖披針葉黃華，不但加速品種繁育速度，還可擴(kuò)大種質(zhì)資源，保持優(yōu)良品種的特性。種子是建立植物無菌體系的良好外植體［4］。但披針葉黃華種子種皮太硬，出苗時(shí)間長［5］。本研究采用披針葉黃華種子作為試材，探討了培養(yǎng)基中不同種類、濃度碳源和激素對(duì)披針葉黃華種子無菌苗萌發(fā)的影響，為今后其組織培養(yǎng)或新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

披針葉黃華種子，MS培養(yǎng)基、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、果糖，6－BA、NAA、2，4－D。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別加入碳源（葡萄糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、果糖），激素（6－BA、NAA、2，4－D），碳源分別設(shè)120、160、200、240mg／L 四個(gè)濃度，激素分別設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0mg／L 五個(gè)濃度，不加碳源、激素為對(duì)照。將配比好的培養(yǎng)基pH調(diào)至6.8，分裝到罐頭瓶中，121℃滅菌20min。

1.2.2 種子處理 將披針葉黃華種子用紗布包好，置于自來水沖洗10min，瀝干水分后，置于超凈工作臺(tái)上，取225粒種子置于75%的酒精溶液中消毒1min，無菌水沖洗5次，用含量8%～9%NaClO的活性氯消毒6min，再將種子用紗布包好放在無菌水中充分沖洗5次，瀝干置于接種盤上備用。

1.2.3 置床及發(fā)芽 預(yù)先將處理好的披針葉黃華種子接種到含有不同濃度碳源（葡萄糖、蔗糖、山梨醇、海藻糖、果糖）不同濃度激素（6－BA、NAA、2，4－D）的 MS培養(yǎng)基中，每瓶3粒，3次重復(fù)。置于27℃光照強(qiáng)度為2 000Lx恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7d，觀察其生長，測(cè)量幼苗生長長度，比較不同種類、濃度碳源以及激素對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長的影響。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用DPS9.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響

2.1.1 不同濃度葡萄糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表1可知，在各濃度葡萄糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子均能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳葡萄糖濃度為160mg／L，與濃度為240mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高濃度葡萄糖培養(yǎng)基中生長。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.2 不同濃度蔗糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表2可知，在各濃度蔗糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳蔗糖濃度為200mg／L，與濃度為240、160mg／L差異顯著，與濃度為120mg／L存在極顯著差異，說明披針葉黃華無菌苗不適宜在較高或較低濃度蔗糖培養(yǎng)基中生長。

表2 不同濃度蔗糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.3 不同濃度山梨醇碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表3可知，在各濃度山梨醇碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，但低濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳山梨醇濃度為160mg／L，與濃度為200、120mg／L間差異顯著，與濃度為240mg／L存在極顯著差異，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高或較低濃度山梨醇培養(yǎng)基中生長。

表3 不同濃度山梨醇對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.4 不同濃度海藻糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表4可知，在各濃度海藻糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，低濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳海藻糖濃度為200mg／L，但與濃度為240、160mg／L差異不顯著，與濃度為120mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較低濃度海藻糖培養(yǎng)基中生長。

表4 不同濃度海藻糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

2.1.5 不同濃度果糖碳源培養(yǎng)基對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響 由表5可知，在各濃度果糖碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能萌發(fā)為無菌苗，低濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有促進(jìn)作用，高濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長有抑制作用，披針葉黃華無菌苗生長的最佳果糖濃度為160mg／L，但與濃度為120、200mg／L間差異不顯著，與濃度為240mg／L差異顯著，說明披針葉黃華無菌苗不宜在較高濃度果糖培養(yǎng)基中生長。

表5 不同濃度果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗生長狀況的影響

由表6可知，在最佳濃度的不同碳源培養(yǎng)基中，披針葉黃華種子都能生長成無菌苗，無菌苗在濃度為160mg／L的葡萄糖碳源的培養(yǎng)基上生長最快（表1）。與濃度為200mg／L的蔗糖存在差異，其次為160mg／L的山梨醇和果糖培養(yǎng)基，200mg／L的海藻糖次之，對(duì)照最差。

表6 不同碳源最適濃度顯著性分析

用葡萄糖、山梨醇、果糖作為碳源時(shí)披針葉黃華無菌苗生長的最佳濃度為160mg／L，而當(dāng)碳源為蔗糖、海藻糖作為碳源時(shí)，其最佳濃度為200 mg／L。由此可見，培養(yǎng)基中碳源種類不同時(shí)，其對(duì)應(yīng)最佳濃度亦不同。

表7 披針葉黃華無菌苗在不同碳源培養(yǎng)基中平均生長速度差異性分析

由表7可知，披針葉黃華無菌苗生長的最佳碳源為山梨醇、蔗糖、葡萄糖，其次為果糖與海藻糖。

2.2 不同激素濃度對(duì)披針葉黃華種子無菌苗生長狀況的影響

由表8、9可以看中，當(dāng)6－BA與NAA或2，4－D以一定比配合使用時(shí)，有些培養(yǎng)基能誘導(dǎo)出無菌苗，且6－BA的愈傷誘導(dǎo)能力明顯強(qiáng)于NAA。0.2mg／L 6－BA ＋0.8mg／L NAA 誘導(dǎo)率達(dá)到22.5%，無菌苗生長率最佳培養(yǎng)基為改良 MS基本培養(yǎng)基0.8mg／L NAA＋0.4mg／L 6－BA，其誘導(dǎo)率達(dá)到26.7%。這足以說明披針葉黃華無菌苗誘導(dǎo)依賴NAA與6－BA的組合。由此可見，不同基因型、不同外植體來源和激素的配比對(duì)植物無菌苗的誘導(dǎo)差異很大。

表8 6－BA與NAA的不同濃度配比對(duì)披針葉黃華無菌苗的影響

表9 6－BA與2、4－D的不同濃度配比對(duì)披針葉黃華無菌苗的影響

3 討論

3.1 不同激素對(duì)種子無菌苗的影響

無菌苗形成過程是一個(gè)植物基因型、外植體來源、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等諸多因素之間相互作用的復(fù)雜過程，其中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、含量及組成比例是調(diào)控植物器官產(chǎn)生無菌苗的主導(dǎo)因素［6］。在很多植物中，誘導(dǎo)愈傷時(shí)使用較多的是單獨(dú) 2，4－D［7－8］或者 2，4－D 和 6－BA 組合［9－10］。而橡膠樹花藥無菌苗的誘導(dǎo)以2，4－D和KT的組合為主［11］。而中國植物研究所通過添加0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA＋1.2 mg／L 2，4－D 3種激素的組合來誘導(dǎo)葉片無菌苗的產(chǎn)生，但是愈傷誘導(dǎo)率的大小在文章中未見有說明［12］。

3.2 碳源對(duì)種子無菌苗的影響

眾所周知，不同的培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)物質(zhì)的成分不同，且同一培養(yǎng)基中不同的糖濃度對(duì)同一種外植體的作用不同。在植物組織培養(yǎng)中，外植體無菌苗的形成與培養(yǎng)基的成分等都密不可分。文心蘭的不同生長發(fā)育時(shí)期所需蔗糖濃度不一。在一定范圍內(nèi)提高糖濃度對(duì)文心蘭各誘導(dǎo)生長階段有明顯的促進(jìn)作用。組織培養(yǎng)試驗(yàn)證明培養(yǎng)基中高滲透勢(shì)或液體培養(yǎng)基有利于營養(yǎng)素和激素的運(yùn)轉(zhuǎn)，有利于根的發(fā)生和形成質(zhì)量。植物組織培養(yǎng)中，在植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中，一般采用蔗糖、果糖和葡萄糖作為碳源。糖對(duì)次生代謝的作用，首先表現(xiàn)在不同的碳源對(duì)次生代謝產(chǎn)物的積累及細(xì)胞的生長不一致［13］。植物離體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)周期短、易規(guī)?；⒉皇芡饨绛h(huán)境干擾而且產(chǎn)量高、化學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)特性好等特點(diǎn)［14］，利用植物離體細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)一直受到學(xué)術(shù)界的重視，也取得了很大進(jìn)展（如紫草寧、人參皂甙、紫杉醇等）［15－16］。無菌苗經(jīng)長期繼代后分化能力的保持問題，一直是細(xì)胞工程研究中的重要課題［17］。已有不少報(bào)道指出，無菌苗長期繼代后，分化能力降低是較為普遍的現(xiàn)象［18］，像胡蘿卜、煙草和水稻，在繼代多次后，無菌苗分化植株的能力就會(huì)完全消失［19－20］也有一些植物的無菌苗在繼代中，它們分化能力是可以很好保持的。如玉米，花粉無菌苗繼代2年后仍有很強(qiáng)的植株再生能力［21］，而無菌苗，有的品種繼代保存了近10年了，仍有很強(qiáng)的再生能力，而有的品種剛剛誘導(dǎo)出無菌苗不長時(shí)間后，就喪失再生能力。其原因可能與披針葉黃華的基因型有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，改變碳源能夠誘導(dǎo)體胚發(fā)生［22－23］。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同碳源對(duì)披針葉黃華無菌苗生長的影響各異。葡萄糖和蔗糖有利于披針葉黃華無菌苗的生長，山梨醇和果糖對(duì)披針葉黃華無菌苗的生長影響較小，而海藻糖不利于披針葉黃華無菌苗的生長。披針葉黃華無菌苗在不同碳源培養(yǎng)基上的生長能力大小不同。其機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。

［1］ 李勇，晁向陽，張永康.披針葉黃華的研究，2007（1）：81－82.

［2］ 曾建飛.披針葉黃華，北京：中國高等植物圖鑒，2002，（2）104－105.

［3］ 朱忠珂，趙寶玉.披針葉黃華總生物堿對(duì)小鼠的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)2003（2）31－32.［4］ 魏春雁.披針葉黃華的研究［M］.長春：吉林科學(xué)出版社，2004.

［5］ 周俊輝，周厚高，劉花全.植物組織培養(yǎng)中的內(nèi)生細(xì)菌污染問題［J］.廣西植物，2003，23（1）：41－47.

［6］ 鄭先波，夏國海，崔紅.無籽西瓜種苗無菌苗生長研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，37（1）：39－43.

［7］ 沈雁，周煥起，曹紅星.不同外源激素對(duì)油棕?zé)o菌苗生長的影響［J］.種子，2010，29（7）：37－39.

［8］ 張文君，楊春華，劉帆.不同激素配比對(duì)草地早熟禾無菌苗形成的影響［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28（2）：187－190.

［9］ 彭麗萍，張遠(yuǎn)兵，胡正和.中國櫻桃離體葉片無菌苗生長的研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（17）：51－53.

［10］ 尹美強(qiáng)，王玉國，溫銀元.梨棗葉片和莖段再生體系的建立［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2005，25（10）：1954－1959.

［11］ Kumari J P，Asokan M P，Sobha S.Somatic embryogenesisand plant regeneration from immature anthers ofHevea brasiliensis（Muell.Arg.）［J］.Current Science，2009，76（9）：1242－1245.

［12］ Kala R G，Kuruvila L，Kumari Jayasree P.Secondary embryogenesis and plant regeneration from leaf derived somatic embryos of Hevea brasiliensi［J］.Journal of plantation crops，2008，36（3）：218－222.

［13］ Jin Hoon Kim，Jeong hwan Yun，Yong Soon Hwang.Pro duction of taxol and taxanes in Taxus brevifolia cell cultures：effect of sugar［J］.Biotechnology，2005，17（1）：101.

［14］ 郭志剛.植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)珍稀名貴藥用植物替代資源的研究進(jìn)展［J］.高科技與產(chǎn)業(yè)化，2005，12：42－43.

［15］ 呂春茂，范海延，姜河.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)合成次生代謝物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，22（1）：1－6.

［16］ 李曉蕙，陳蕾.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12（5）：74－75.

［17］ Hao Y J，Deng X X.Stress treatments and DNA methylation affect somatic embryogenesis from citrus callus［J］.Acta Bot Sin，2002，44（6）：673－677.

［18］ Etienne H，Bertrand B.Somaclonal variation in coffea arabica：effects of genotype and embryogenic cell suspension age on frequency and phenotype of variants［J.Tree Physiol，2003，23（6）：419－426.

［19］ Button J.The effects of some carbonhydrates on the growth and organization of citrus ovular callus ［J］.Z Pflanzenphysiol，2001，88：61－68.

［20］ Kochba J，Spiegel Roy P，Neumann H.Stimulation of embryogenesis in citrus tissue culture by galactose［J］.Naturwissenschaften，2004，65：261－262.

［21］ 武琳，鐘敏，涂國全.理化因子預(yù)處理對(duì)玉米芯糖化的影響［J］.江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34（1）：98－101.23（6）419－426.

［22］ 張俊娥，郭文武，鄧秀新.無菌苗倍性變化及其與體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力的關(guān)系［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2006，33（7）：647－654.

［23］ 范國強(qiáng)，翟曉巧，蔣建平.不同種泡桐葉片無菌苗生長及其植株再生［J］.林業(yè)科學(xué)，2002，38（1）：29－35.