氧化低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響

何玉萍，江 湧，何玉珊，許翌嘉

動(dòng)脈硬化（AS）是動(dòng)脈血管壁的一種慢性炎癥性疾病［1］，細(xì)胞黏附分子（CAMs）是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間相互黏附的糖蛋白，正常情況下呈低水平表達(dá)，在炎性反應(yīng)刺激下表達(dá)明顯上調(diào)。研究表明，AS處內(nèi)皮細(xì)胞分泌的黏附分子增加，炎性基因的表達(dá)也增加［2］。本實(shí)驗(yàn)采用單核細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞（MC－EC）聯(lián)合培養(yǎng)的方法，觀察氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV304）CAMs表達(dá)的影響，探討ox－LDL損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料 ECV304細(xì)胞株（中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)），人類單核細(xì)胞系U937（上海細(xì)胞生物研究所）；RPMI－1640培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO）；胎牛血清（美國(guó) GIBCO）；低密度脂蛋白（LDL，美國(guó)SIGMA）；單克隆抗體CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE、IgG－PE、IgG－FITC（均是美國(guó)PharMingen產(chǎn)品）；流式細(xì)胞儀：（美國(guó)BECKMAN COULTE公司 ALTRA型），四色熒光，配套EXPO 32采集分析軟件。

1．2 ox－LDL的制備 將LDL置于含10μmol／L CuSO4的PBS（pH7．2）溶液中，37℃溫育24h，再將ox－LDL液置含200 μmol／L EDTA的PBS 4℃中透析24h，超濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 MTT法檢測(cè)不同濃度ox－LDL對(duì)細(xì)胞活性的影響細(xì)胞以5×104個(gè)／mL細(xì)胞數(shù)接種入96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)（約24h），分別加入ox－LDL高濃度組（100μg／mL）、中濃度組（50μg／mL）、低濃度組（25μg／mL），正常對(duì)照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，每孔加入10g／L的 MTT 10μL，培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置微量振蕩器上振蕩10 min，酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570nm）測(cè)定吸光值（OD），篩選ox－LDL適宜作用濃度。

1．3．2 ox－LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響 將ECV304細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至穩(wěn)定狀態(tài)（約24 h），加入50μg／mL ox－LDL，對(duì)照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加入含4×104人類單核細(xì)胞系U937細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞懸液，37℃孵育30min，移去培養(yǎng)液，用PBS輕洗2遍，去除未黏附的細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA混合液消化收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞間黏附分子－1（ICAM－1，CD54）、血管細(xì)胞黏附分子－1（VCAM－1，CD106）、E－選擇素（CD62E）和P－選擇素（CD62P）。

1．4 FCM檢測(cè) VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD62P的表達(dá)率 收集上述單細(xì)胞懸液，PBS洗兩次，分別加入CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE單克隆抗體各10 μL，室溫避光孵育30min后，PBS洗2遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其結(jié)果以陽(yáng)性百分率表示。每份樣本均設(shè)陰性對(duì)照（加相應(yīng)IgG抗體），以消除本底熒光的影響。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16．0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié) 果

2．1 MTT檢測(cè)結(jié)果 ox－LDL作用的各組細(xì)胞活性均下降，與正常組比較，高、中濃度組有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0．05），而低濃度組無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，提示50μg／mL ox－LDL為適宜的作用濃度。詳見(jiàn)表1。

表1 ox－LDL不同濃度作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV304活性的影響（±s）

表1 ox－LDL不同濃度作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV304活性的影響（±s）

與正常組比較，1）P＜0．05

組別 n MTT（OD值）正常組10 0．771±0．062低濃度組 10 0．699±0．067中濃度組 10 0．624±0．0301）高濃度組 10 0．589±0．0551）

2．2 ox－LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響 ox－LDL作用損傷組細(xì)胞表面黏附分子VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD 62P表達(dá)率均明顯增高，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。詳見(jiàn)表2。

表2 ox－LDL對(duì)ECV304細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響（±s） %

表2 ox－LDL對(duì)ECV304細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響（±s） %

與正常組比較，1）P＜0．05

組別 n VCAM－1 ICAM－1 CD62E CD62P正常組 10 3．66±1．19 50．82±6．62 12．27±1．43 5．54±0．76 ox－LDL損傷組 30 9．77±2．461） 77．62±3．181） 23．59±2．841） 18．96±2．171）

3 討 論

AS是危害人類健康最大的疾病之一，是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。自Ross提出AS發(fā)病機(jī)制的“損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)至今，VCE損傷在AS的形成與發(fā)展中的地位日趨受到關(guān)注。在AS解剖學(xué)證據(jù)出現(xiàn)之前已有內(nèi)皮功能紊亂的表現(xiàn)［3，4］，而VEC功能紊亂是AS發(fā)病的早期關(guān)鍵性環(huán)節(jié)［5］。

ox－LDL是AS明確的危險(xiǎn)因子，動(dòng)脈壁中ox－LDL的存在是造成動(dòng)脈壁持續(xù)損傷重要因素之一，ox－LDL可直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路改變內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性，介導(dǎo)單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［6，7］。人AS的斑塊中有ICAM－1的表達(dá)，并在AS的病理過(guò)程中起重要作用［8］。高血脂患者血中的可溶性的ICAM－1、VCAM－1均升高，認(rèn)為血中可溶性ICAM－1、VCAM－1是反應(yīng)動(dòng)脈粥樣硬化的早期變化指標(biāo)［9］。MC－EC黏附是內(nèi)皮細(xì)胞功能受損而處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)之一，兩種細(xì)胞黏附不僅是物理接觸，而且涉及MC、EC細(xì)胞表面諸多分子之間的相互作用，在相互作用過(guò)程中兩種細(xì)胞的功能均發(fā)生相應(yīng)變化，促進(jìn)細(xì)胞CAMs表達(dá)，而CAMs介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及損傷作用，被認(rèn)為是AS重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)，可作為炎癥活動(dòng)的指標(biāo)［2，10］。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì) U937－ ECV304聯(lián)合培養(yǎng)的方法，用ox－LDL為誘導(dǎo)損傷因素，F(xiàn)CM進(jìn)行分析ECV304細(xì)胞表面VCAM－1、ICAM－1、E－選擇素、P－選擇素的表達(dá)，探討ox－LDL致VEC損傷機(jī)制；結(jié)果顯示，ox－LDL促使內(nèi)皮細(xì)胞CAMs表達(dá)明顯上調(diào)，提示ox－LDL在內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子合成或誘導(dǎo)過(guò)程中扮演了較為重要的角色，ox－LDL刺激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CAMs表達(dá)增高，而CAMs的高表達(dá)，又促進(jìn)單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，參與AS化的形成和發(fā)展。

VEC是多種危險(xiǎn)因子作用的重要靶器官。Ox－LDL通過(guò)介導(dǎo)單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞CAMs的表達(dá)，致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，損傷VEC。阻斷或抑制ox－LD對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害，能有效預(yù)防、治療心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

［1］ Andersson J，Libby P，Hansson GK．Adaptive immunity and atherosclerosis［J］．Clin Immunol，2010，134（1）：33－46．

［2］ Dai G，Kaazempur－Mofrad MR，Natarajan S，et al．Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis－susceptible and resistant regions of human vasculature［J］．PNAS，2004，101（41）：14871－14876．

［3］ 郭渝成，張為，陳莉，等．微血栓形成與內(nèi)皮細(xì)胞損傷間關(guān)系的臨床及實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)微循環(huán)，2002（3）：141－143．

［4］ Quinones MJ，Nicholas SB，Lyon CJ．Insulin resistance and the endothelium［J］．Curr Diab Rep，2005，5（4）：246－253．

［5］ Falk E．Pathogenesis of atherosclerosis［J］．J Am Coll Cardiol，2006，47（8Suppl）：7－12．

［6］ Vannini N，Pfeffer U，Lorusso G，et al．Endothelial cell aging and apoptosis in prevention and disease：E－selectin expression and modulation as a model［J］．Curr Pharm Des，2008，14（3）：221－225．

［7］ Akahashi H，Hara K．Cardiovascular diseases and oxidative stress［J］．Rinsho Byori，2003，51（2）：133－139．

［8］ Hajilooi M，Sanati A，Ahmadieh A，et al．Circulating ICAM－1，VCAM－1，E－selectin，P－selectin，and TNF－αⅡin patients with coronary artery disease［J］．Immunol Invest，2003，32（4）：245－257．

［9］ Mansoor MA，Seljeflot I，Arnese N，et al．Endothelial cell adhesion molecules in healthy adults during acute hyperhomocysteinemia and mild hypertriglyceridemia［J］．Clin Biochem，2004，37（5）：408－414．

［10］ 蔡強(qiáng)軍．單核－內(nèi)皮細(xì)胞相互作用與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展［J］．中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2002，10（1）：83－85．