直腸癌遠(yuǎn)端黏膜Cox－2及Bcl－2蛋白的表達(dá)及其臨床意義

臧金林， 李紅梅， 孟 濤， 孫 筍， 閻桂蕓， 周東風(fēng)

直腸癌的治療是以手術(shù)為主的綜合治療。盡管遵循TME原則的保肛手術(shù)可以顯著降低局部復(fù)發(fā)率并提高患者的生活質(zhì)量，但外科醫(yī)師在直腸癌根治保肛術(shù)時(shí)對(duì)腫瘤遠(yuǎn)端切緣的切除范圍常難以把握。直腸癌仍有5% ～15%的局部復(fù)發(fā)率［1］，而手術(shù)范圍不合理，特別是直腸遠(yuǎn)端切緣切除的不充分是直腸癌局部復(fù)發(fā)的主要原因之一。顯然，合理的手術(shù)切除范圍是提高直腸癌患者術(shù)后生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。在腫瘤的局部浸潤(rùn)過(guò)程中，癌邊緣的組織細(xì)胞常檢測(cè)不到異型性，但實(shí)際已經(jīng)存在分子水平的變異。本研究旨在通過(guò)觀(guān)察不同距離的直腸癌遠(yuǎn)端黏膜Cox-2及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，并與腫瘤組織和正常黏膜比較，明確直腸癌手術(shù)的遠(yuǎn)端安全切除范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本選自2008年9月至2010年1月期間在青島市立醫(yī)院行根治手術(shù)的54例直腸癌患者，其中男32例，女22例;年齡33～70歲，平均年齡57歲。所有患者均為中分化腺癌，其中腫瘤直徑＞3 cm 45例，＜3 cm 9例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ期23例，Ⅳ期7例。取經(jīng)手術(shù)切除的新鮮直腸癌組織，直腸癌遠(yuǎn)端2 cm、3 cm的黏膜組織，并選取20例同期經(jīng)手術(shù)切除的直腸正常組織的石蠟切片作對(duì)照。

1.2 試劑與方法 將手術(shù)切除的組織沿對(duì)側(cè)緣縱行剖開(kāi)，平鋪，自然狀態(tài)下剪取大小為0.2 cm×2.0 cm的標(biāo)本，福爾馬林液中固定，石蠟包埋，以4 μm為平均厚度進(jìn)行切片，行Bcl-2、Cox-2免疫組化染色(S-P法)。Cox-2鼠單克隆抗體(濃縮型)購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，Bcl-2單克隆抗體(即用型)及即用型免疫組化Elivision plus試劑盒(鼠/兔)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。具體實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定 Cox-2、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)染色(黃色或棕黃色顆粒)為主，細(xì)胞膜可有少量染色。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，400倍顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)按參考文獻(xiàn)［2］的方法，根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量分別記分。不著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜30%為1分，30% ～70%為2分，＞70%為3分。按兩者之和判斷結(jié)果，≥2分為陽(yáng)性(+)，＜2分為陰性(－)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組數(shù)據(jù)間采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

Cox-2、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)染色(黃色或棕黃色顆粒)為主，細(xì)胞膜可有少量染色。Cox-2蛋白在腫瘤組織，腫瘤遠(yuǎn)端2 cm、3 cm黏膜組織，正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 81.48%、20.01%、18.11%、10.00%;Bcl-2 蛋白在腫瘤組織，腫瘤遠(yuǎn)端2 cm、3 cm黏膜組織，正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 77.78%、20.75%、22.56%、5.00%。直腸癌遠(yuǎn)端2 cm、3 cm黏膜組織與腫瘤組織中Cox-2和Bcl-2蛋白的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，與直腸正常黏膜組織中的表達(dá)差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，見(jiàn)表1。在不同的腫瘤臨床病理參數(shù)中，直腸癌遠(yuǎn)端2 cm、3 cm黏膜組織中Cox-2和Bcl-2蛋白的表達(dá)也無(wú)明顯差異(均P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表1 Cox-2、Bcl-2蛋白在直腸各部位黏膜中的表達(dá)計(jì)分(x±s)

表2 直腸癌遠(yuǎn)端黏膜Cox-2、Bcl-2蛋白表達(dá)計(jì)分值與臨床病理特征間的關(guān)系(x±s)

3 討論

直腸癌是臨床上常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤。合理的手術(shù)切除范圍是提高直腸癌患者術(shù)后生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。手術(shù)范圍不合理，特別是直腸遠(yuǎn)端切緣切除不充分是直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)的主要原因之一［3］。如何判定直腸下段切除范圍是否合理，已成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。對(duì)于直腸癌保肛手術(shù)的安全切緣，過(guò)去主要通過(guò)病理學(xué)方法進(jìn)行判斷。但病理學(xué)檢測(cè)手段易受主觀(guān)因素影響，尤其是對(duì)極微量的腫瘤細(xì)胞或微小轉(zhuǎn)移灶缺乏靈敏度。在腫瘤的局部浸潤(rùn)中，癌邊緣的組織細(xì)胞常檢測(cè)不到異型性，但實(shí)際已有分子水平的變異。目前一致認(rèn)為直腸癌遠(yuǎn)端腸壁“分子定界”的范圍對(duì)于指導(dǎo)直腸癌保肛手術(shù)切除腫瘤下切緣的長(zhǎng)度有重要意義，并由此提出了直腸癌遠(yuǎn)切緣“分子生物學(xué)長(zhǎng)度”的概念，即以分子生物學(xué)方法檢測(cè)直腸癌遠(yuǎn)切緣多種分子生物學(xué)指標(biāo)的表達(dá)，以此界定分子生物學(xué)長(zhǎng)度較為安全實(shí)用。本研究通過(guò)檢測(cè)直腸癌遠(yuǎn)切緣黏膜Cox-2及Bcl-2蛋白的表達(dá)，來(lái)了解直腸癌遠(yuǎn)切緣黏膜細(xì)胞在分子水平上的變異情況。Cox-2蛋白在大多數(shù)正常組織中檢測(cè)不到，其是一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)蛋白(inducing immediate 2 early gene)，可由多種因素所誘導(dǎo)，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、促癌劑等。腸上皮細(xì)胞Cox-2表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生，Cox-2同時(shí)能促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)，為腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供所必需的營(yíng)養(yǎng)［4］。Bcl-2蛋白通過(guò)抑制細(xì)胞的程序死亡，破壞細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［5］。所以通過(guò)對(duì)Cox-2、Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)，可推測(cè)直腸癌遠(yuǎn)切緣是否有原發(fā)性癌前病變，以判斷是否適合保肛手術(shù)。

本研究結(jié)果表明，在腫瘤組織、癌遠(yuǎn)端2 cm黏膜、遠(yuǎn)端3 cm黏膜組織內(nèi)均有Cox-2、Bcl-2的表達(dá)，但遠(yuǎn)端黏膜內(nèi)兩蛋白的表達(dá)與腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，但與正常黏膜比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);直腸癌遠(yuǎn)端2 cm、遠(yuǎn)端3 cm黏膜處的Cox-2蛋白及Bcl-2蛋白的表達(dá)與直腸癌的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等生物學(xué)特性均無(wú)相關(guān)性(均P＞0.05)。提示直腸癌遠(yuǎn)端2 cm或3 cm黏膜切緣的分子水平并未發(fā)生明顯的異常改變，這較常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)更加準(zhǔn)確可靠。由此我們推斷，直腸癌手術(shù)遠(yuǎn)端切緣切除2 cm即能滿(mǎn)足保肛手術(shù)的需要。另外，其他腫瘤學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)也可進(jìn)一步證實(shí)遠(yuǎn)端切緣切除2 cm是否可靠，這也是我們下一步的工作計(jì)劃。

綜上所述，常規(guī)的病理學(xué)檢查結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)可提高手術(shù)切緣診斷的敏感性，對(duì)預(yù)防患者術(shù)后復(fù)發(fā)和評(píng)估預(yù)后都具有重要的意義。從分子水平重新評(píng)價(jià)和確定腫瘤的手術(shù)切緣還待進(jìn)一步的深入探究。

［1］ Palmer G，Martling A，Cedermark B，et al.A population-based study on the management and outcome in patients with locally recurrent rectal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2007，14(2):447-454.

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［3］ 龐國(guó)棟，周東風(fēng)，牛軍.直腸癌安全遠(yuǎn)切緣研究進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2010，13(5):381-383.

［4］ Hoellen F，Kelling K，Dittmer C，et al.Impact of cyclooxygenase-2 in breast cancer［J］. Anticancer Res，2011，31(12):4359-4367.

［5］ Petri?or O，Giu?cǎ SE，Sajin M，et al.Ki-67，p53 and Bcl-2 analysis in colonic versus rectal adenocarcinoma［J］.Rom J Morphol Embryol，2008，49(2):163-171.