孑遺植物水松基因組DNA 提取及ISSR 反應(yīng)體系建立

鄭世群，劉金福，吳則焰，洪 偉，徐道煒，何中聲

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州350002)

水松(Glyptostrobus pensilis)屬杉科水松屬，是我國(guó)特有珍稀孑遺樹(shù)種(國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物).生長(zhǎng)于沼澤地，耐水濕，是造船和造橋的良材;樹(shù)根輕松、浮力大，可以用來(lái)做救生工具和木塞;枝葉和果實(shí)可入藥［1］.水松在古生代曾廣布于北半球，由于地史因素和人為活動(dòng)影響，數(shù)量日益減少，已處于瀕危狀態(tài)，目前僅零星分布于我國(guó)南方.在研究杉科植物系統(tǒng)發(fā)育、古植物學(xué)和第四紀(jì)冰川氣候等方面，水松具有重要科學(xué)價(jià)值，被世界保護(hù)監(jiān)測(cè)中心列為稀有種，被《中國(guó)植物紅皮書(shū)》列為瀕危樹(shù)種［2］.目前水松分布范圍不斷縮小且呈片段化，居群數(shù)量劇烈下降，大部分分布地僅剩幾株孤立木，天然更新難以進(jìn)行，幼苗幼樹(shù)幾乎沒(méi)有，且病蟲(chóng)危害嚴(yán)重，加之人為干擾破壞，水松生存與繁殖面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn).如何保護(hù)水松林稀有珍貴基因與種質(zhì)資源、擴(kuò)大水松林自然資源已成當(dāng)務(wù)之急.

水松因其瀕危狀況受到眾多學(xué)者高度關(guān)注.韓麗娟等［1-2］對(duì)水松生物學(xué)特性和保護(hù)、次生韌皮部解剖及其系統(tǒng)位置進(jìn)行分析，斯纓等［3］研究水松葉總黃酮含量，李發(fā)根等［4］探討了水松地理分布和瀕危原因，鄭世群等［5］針對(duì)瀕危原因提出保護(hù)對(duì)策，吳則焰等［6-11］對(duì)水松種群生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，但其分子生態(tài)學(xué)研究較少.簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)(inter-simple sequence repeats，ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)具有快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［12］，已廣泛用于植物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、種質(zhì)資源鑒定、植物分類(lèi)、進(jìn)化和遺傳多樣性分析等方面［13］.作為基于PCR的一種分子標(biāo)記，其擴(kuò)增結(jié)果易受Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物等因素影響，DNA模板質(zhì)量及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是獲得可靠分子標(biāo)記結(jié)果的前提［14］.根據(jù)Li et al［15］的ISSR反應(yīng)體系重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果并不理想.考慮到反應(yīng)體系會(huì)直接影響研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室擬研究獲得高質(zhì)量水松基因組DNA的方法，探討建立適合于水松的ISSR-PCR反應(yīng)體系，為水松分子標(biāo)記和遺傳多樣性研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)材料于2008年12月至2009年3月采自于水松主要分布區(qū)福建屏南、三明、南平、福州、江西弋陽(yáng)、廣東斗門(mén)等地，共9個(gè)居群，合計(jì)100株.每個(gè)居群根據(jù)其分布情況隨機(jī)選取代表性樣株，每樣株間隔距離至少5 m以上，將采集的每株幼嫩葉片裝入自封袋中，用硅膠干燥保存，在實(shí)驗(yàn)室用液氮處理后，-40℃冷凍保存.

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器:高速離心機(jī)(Beckman Avanti30 Centrifuge)，紫外分光光度計(jì)(WFZ800-D3B)，Thermo PCR(GebeAmpTM PCR Stystm 9700)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000TM).

主要試劑:dNTP、Buffer(10×PCR Buffer)、Marker D501A、Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自寶生生物工程有限公司;隨機(jī)引物和ISSR引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Tris、HCl、EDTA、CTAB、NaCl、β-巰基乙醇、硼酸、PVPP、乙醇、氯仿、異戊醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水松基因組DNA提取 ①取0.5 g水松嫩葉放入液氮中研磨成粉，在研磨過(guò)程中，加入適量PVPP，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，加入800 μL 65 ℃的2 ×CTAB 提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2%CTAB)，另加入16 μL 5%β-巰基乙醇，充分混勻，放在65 ℃水浴保溫30-60 min(每隔15 min搖勻1次);②加入600 μL氯仿—異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，在12000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)入另一離心管;③重復(fù)第2步，即用氯仿-異戊醇(24∶1)再抽提一次;④在水相中加入1/5體積5 mol·L-1NaCl，再加入2/3體積冰冷的異丙醇，輕輕混勻后，置于-20℃ 30 min，然后10000 r·min-1離心5 min收集沉淀;⑤將沉淀用75%乙醇洗2次，在室溫下自然風(fēng)干4-10 min;⑥將此沉淀溶于合適體積(50-100 μL)0.1 × TE 緩沖液(1.0 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0)，-20℃保存或4℃待用.

1.3.2 水松基因組DNA的檢測(cè) 將提取的DNA樣品適當(dāng)稀釋?zhuān)谧贤夥止夤舛扔?jì)上測(cè)定D260nm和D280nm處的吸收值，計(jì)算DNA樣品濃度.采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，檢測(cè)DNA完整性和RNA消化情況.1.3.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化 選用正交設(shè)計(jì)方案優(yōu)化反應(yīng)體系(表1).表中編號(hào)即正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9個(gè)處理，以采自福州森林公園的水松DNA為模板，引物為811號(hào)(GAGAGAGAGAGAGAGAC)，反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系中含有2.0 μL 10 ×buffer緩沖液和相應(yīng)體積的ddH2O［16-19］.

PCR反應(yīng)所用程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，最后在72℃延伸10 min，4 ℃保存.

表1 ISSR-PCR體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design for ISSR-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果

經(jīng)過(guò)提取與優(yōu)化的水松基因組DNA呈米白色絮狀和無(wú)色透明沉淀，電泳結(jié)果呈均一條帶，說(shuō)明提取的DNA較純，基本去除了蛋白質(zhì)、多糖和酚類(lèi)等雜質(zhì)(圖1).水松基因組DNA的D260nm與D280nm的比值在1.75-1.85范圍內(nèi)，說(shuō)明DNA純度較高，符合要求.

2.2 ISSR反應(yīng)體系確定

圖2為正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果，由于Taq DNA聚合酶、引物、dNTP和DNA濃度不同，處理效果存在較大差異.

圖2 ISSR-PCR正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The orthogonal design results of ISSR-PCR

圖1 DNA電泳檢測(cè)圖Fig.1 The result of genomic DNA gel electrophoresis

dNTP濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致聚合酶的錯(cuò)誤摻入，濃度過(guò)低又會(huì)影響合成效率，甚至?xí)^(guò)早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增結(jié)果.在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度對(duì)擴(kuò)增效果影響較明顯，當(dāng)dNTP濃度為0.18 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶較少，特異性也不強(qiáng);當(dāng)dNTP濃度為0.12 mmol·L-1時(shí)，擴(kuò)增條帶明顯增多，且譜帶很亮.故選擇 dNTP 濃度為 0.12 mmol·L-1.

DNA模板含量是制約擴(kuò)增產(chǎn)物得率及特異性的一個(gè)重要因子，模板含量過(guò)低，分子碰撞幾率低，偶然性大，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)或不穩(wěn)定;模板含量過(guò)高，又會(huì)相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增.水松ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)DNA模板含量許可范圍較大，30-50 ng·μL-1均可擴(kuò)增出條帶.因此，30 ng的模板DNA即可滿足擴(kuò)增需要.

在PCR反應(yīng)中，Taq DNA聚合酶使用量也是影響實(shí)驗(yàn)的重要因素.高濃度Taq DNA聚合酶不僅成本高，且易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物;Taq DNA聚合酶濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成效率下降.由表1和圖2可知，在20 μL反應(yīng)體系中，使用2.0 U Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的條帶最清晰，且數(shù)量最多，則選擇的Taq DNA聚合酶的終濃度為2.0 U·μL-1.

在PCR反應(yīng)中，引物濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增量不足，條帶很少;濃度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生新的位點(diǎn).即選擇引物濃度為 0.12 umol·L-1.

在參考前人研究基礎(chǔ)上［18］將Mg2+濃度定位于 2.0 mmol·L-1，Buffer用量定位于 2.0 μL.所以在20 μL的ISSR體系中，各反應(yīng)成分用量見(jiàn)表2.

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，水松ISSR擴(kuò)增最佳反應(yīng)系:1×Buffer緩沖液，2.0 U Taq DNA 聚合酶，0.12 mmol·L-1dNTP，0.12 umol·L-1引物，DNA模板30 ng·μL-1，dd H2O 補(bǔ)足至體積為 20 μL.反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán) 35 次，72℃延伸10 min，4℃保存.

2.3 ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

篩選出的10條ISSR引物對(duì)不同種源水松共擴(kuò)增出95條譜帶(表3)，其中多態(tài)性條帶39條，多態(tài)性條帶百分率為39.98%.平均每條引物擴(kuò)增出9.5條譜帶和3.9條多態(tài)性條帶.引物873擴(kuò)增出的條帶最多(13條)，其多態(tài)性條帶為54.0%;引物840擴(kuò)增出的條帶最少(7條)，多態(tài)性為28.57%.

表2 ISSR-PCR反應(yīng)成分用量Table 2 Composition of reaction on ISSR-PCR

表3 篩選出的引物及其擴(kuò)增結(jié)果Table 3 The sequence of 10 primers and amplified results

3 討論

DNA模板質(zhì)量直接影響DNA分子標(biāo)記的分析結(jié)果.水松植物富含多酚和多糖，但不同發(fā)育時(shí)期存在較大差異，且居群間差異較大.因此，總結(jié)出一種普遍適用的基因組DNA提取方法較困難.運(yùn)用改良CTAB法提取成年植株新鮮嫩葉的DNA，其DNA純度高、質(zhì)量好，可以直接用于DNA分子標(biāo)記.

有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報(bào)道較多，但大部分研究采用簡(jiǎn)單梯度試驗(yàn)方法對(duì)每個(gè)因素的最佳水平進(jìn)行摸索，需進(jìn)行多次梯度試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程繁瑣，且不能兼顧到各因素間的交互作用，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果判斷缺少量化，缺乏一定標(biāo)準(zhǔn).本實(shí)驗(yàn)采用的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有均衡分散、綜合可比、效用明確的特點(diǎn)，確立了適合水松ISSR-PCR反應(yīng)體系，試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性高、重復(fù)性好.

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