miRNA－142－5p在特應(yīng)性皮炎中的表達(dá)及其靶基因預(yù)測(cè)＊

肖能鑫，史丙俊，刁慶春，王修勇，蔣有讓?zhuān)Z國(guó)富

（重慶市第一人民醫(yī)院皮膚病與性病科，重慶400011）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚疾病。多自嬰兒期起病，病情遷延反復(fù)。其病因及發(fā)病機(jī)制還未完全清楚，目前考慮為一種多基因病，涉及環(huán)境、基因及免疫之間的相互作用。近年來(lái)，一類(lèi)新型微RNAs（microRNAs，miRNAs）分子在醫(yī)學(xué)學(xué)科的研究中備受關(guān)注，其為一類(lèi)長(zhǎng)度大約為20～25個(gè)核苷酸小分子RNA，分布廣泛。據(jù)推測(cè)，miRNAs可負(fù)反饋調(diào)節(jié)人類(lèi)約1／3基因編碼的mRNA［1］。miRNA可通過(guò)兩種機(jī)制致使特定基因的沉默，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育及各種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)功能。研究miRNA以及其生物學(xué)功能，特別研究其對(duì)腫瘤的負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用，是生命醫(yī)學(xué)研究的最新方向之一。近年來(lái)，運(yùn)用基因芯片與高通量測(cè)序技術(shù)，已篩選出多種與疾病相關(guān)miRNA，證實(shí)了miRNA與人類(lèi)重大疾病（如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫性疾病等）的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性［2］。目前尚少有相關(guān)的文獻(xiàn)資料關(guān)于AD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中miRNA的研究。本研究初步探索AD患者PBMC中miRNA的變化，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其靶基因，旨在為研究AD的分子調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年10月至2012年2月本院皮膚科門(mén)診AD患者8例（觀察組），其中男2例，女6例；年齡3～16歲，平均（8.0±3.8）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合 Hanifin ＆ Rajka AD診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）3～16歲患者；（3）病程1年以上，每年緩解期小于3個(gè)月者。排除標(biāo)準(zhǔn)：血液常規(guī)及肝、腎功能檢查有嚴(yán)重異常的患者；患有傳染病、精神疾病、血液疾病、腫瘤、結(jié)締組織病、糖尿病、心臟病等系統(tǒng)疾病者；近1個(gè)月內(nèi)系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素藥物或免疫抑制劑者。選擇同期年齡、性別與觀察組相匹配的健康體檢兒童6例為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 miRcute miRNA提取分離試劑盒（離心柱型）、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒、miRNA－142－5P和has－U6檢測(cè)引物均購(gòu)天根生化科技有限公司。

1.2.2 PBMC分離及miRNA的提取分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMC；miRNA的提取分離，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取分離miRNA，而后進(jìn)行純度和濃度的檢測(cè)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成miRNA cDNA第一鏈 首先進(jìn)行miRNA 3′末端加尾處理，所得的Poly（A）反應(yīng)液，取2μL配制cDNA反應(yīng)體系進(jìn)行下一步cDNA第一鏈合成，所得的cDNA第一鏈置－20℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real－time PCR） 采用SYBR GreenI嵌合法，以U6為內(nèi)參照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。本實(shí)驗(yàn)采用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線［3］，每種濃度設(shè)2個(gè)平行復(fù)孔。按照上述real－time PCR條件，對(duì)前期制備的各樣本的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行miRNA－142－5p檢測(cè)。每個(gè)miRNA做1次PCR，每個(gè)樣本均做3個(gè)平行復(fù)孔，取其平均值分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 首先計(jì)算所有標(biāo)本miRNA－142－5p和U6的3個(gè)重復(fù)孔的平均CT值，將其作為每個(gè)樣本的實(shí)際CT值，將同一樣本miRNA－142－5p CT值減去其相應(yīng)U6的CT值，獲得△CT值，在所有PBMC樣本的△CT值中選擇最大值△CT（max）作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)，用其它樣本的△CT值減去△CT（max），得到每一個(gè)樣本的△△CT值，最后求得每一個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量2－△△CT。

1.2.6 miRNA－142－5p靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用 miRanda、miRDB、PicTar、miRWalk、RNA22、Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，選取至少5種計(jì)算方法均能預(yù)測(cè)到的基因作為其潛在靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，相對(duì)表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA－142－5p real－time PCR擴(kuò)增曲線及融解曲線 采用SYBR Green I嵌合法檢測(cè) miRNA－142－5p的表達(dá)，在所有的樣本中均能得到良好的擴(kuò)增。miRNA－142－5p和內(nèi)參U6擴(kuò)增效率基本一致（S值差絕對(duì)值小于0.1），可以用2－△△CT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。各樣本融解曲線呈單峰，說(shuō)明擴(kuò)增無(wú)二聚體形成，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，見(jiàn)圖1、2。

圖1 miRNA－142－5p擴(kuò)增曲線

2.2 兩組PBMCs中miRNA－142－5p表達(dá)水平比較 miRNA－142－5p在觀察組患者PBMC中的相對(duì)表達(dá)量為（72.16±20.94），在對(duì)照組PBMC中的相對(duì)表達(dá)量為（18.79±13.19），AD患者的PBMCs中 miRNA－142－5p表達(dá)均上調(diào)，其表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.02）。

2.3 miRNA－142－5p靶基因預(yù)測(cè) 5或6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)預(yù)測(cè)出靶基因數(shù)目為39個(gè)，其中包括：MAGI2、MARCH6、IGF2BP3、DCBLD2、CPEB2、ADPRH、ZNF569、SH3D19、HIPK1、CENTB2、SGMS1、SACS、HNRPH3、LRP2、MYCN、OTX2、PCDH9、PCTK2、LRP1B、ATG16L1、BTBD7、CXCR7等。結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到相關(guān)靶基因的信息，它們參與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等各個(gè)方面的調(diào)控。

圖2 miRNA－142－5p融解曲線

3 討 論

miRNA己成為細(xì)胞生物學(xué)、基因遺傳學(xué)以及臨床學(xué)科等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。其通過(guò)mRNA的降解或序列特異性抑制來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化與凋亡等一系列的重要生物學(xué)進(jìn)程［4］。miRNA參與正常免疫系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控［5］和慢性炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程［6］，機(jī)體細(xì)胞在接收到內(nèi)源性或外源性信號(hào)后，miRNA可出現(xiàn)相應(yīng)表達(dá)，其作為機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化后一種早期反應(yīng)，參與了固有免疫應(yīng)答過(guò)程。

miRNA－142位于人類(lèi)17號(hào)染色體上，有2個(gè)亞單位：miRNA－142－3p和 miRNA－142－5p。成熟 miRNA－142－5p單鏈序列為：5′－CAUAAAGUAGAAAGCACUAC－3′。miRNA－142在造血干細(xì)胞的分化中具重要作用。miRNA－142－5p在T細(xì)胞中有明顯的表達(dá)，Wu等［7］用基因芯片技術(shù)檢測(cè)了初始T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了miRNA－142－5p等在效應(yīng)性T細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而在初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。Landgraf等［8］研究亦表明，miRNA－142在外周血CD8＋T細(xì)胞中表達(dá)上升。Annoni等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－142可能通過(guò)調(diào)控抗原在抗原提呈細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，從而使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。Nakamachi等［10］研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎患者，miRNA－142在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的膠原纖維中表達(dá)上調(diào)。2010年，Sonkoly等［6］研究了AD患者皮損中miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，AD患者皮損中共有44個(gè)miRNA差異性表達(dá)，其中10個(gè)miRNA上調(diào)表達(dá)，包括miRNA－142－5p，miRNA－142－3p。本研究表明，與健康人相比，miRNA－142－5p在 AD患者PBMC中表達(dá)上調(diào)，與Sonkoly等［6］關(guān)于miRNA－142－5p在AD患者皮損的研究結(jié)果相一致。

目前關(guān)于miRNA－142－5p的相關(guān)報(bào)道較少，其在AD的發(fā)病過(guò)程的作用還不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)查找到miRNA－142－5p可與多個(gè)基因3′UTR相結(jié)合，下一步需要對(duì)其可能的靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為AD的靶基因治療等提供新的依據(jù)。

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