骨形成蛋白－2在上頜骨快速牽引骨愈合中的作用＊

姚玉勝，王程越，王桂君

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科，遼寧錦州121000；2.遼寧省錦州市中心醫(yī)院修復(fù)科，遼寧錦州121000；3.遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，遼寧錦州121000）

作為一種創(chuàng)傷小、出血少的治療骨缺損及畸形新技術(shù)，經(jīng)骨縫牽引成骨術(shù)已引起各科醫(yī)生的重視［1］。Liu等［2］以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象發(fā)現(xiàn)，重組人骨形成蛋白－2（recombinant human bone morphogenetic protein－2，rhBMP－2）對(duì)骨縫及周圍組織的改建有較明顯促進(jìn)作用。范偉等［3］也認(rèn)為BMP－2單獨(dú)應(yīng)用即有較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨活性。為繼續(xù)探索快速?gòu)椥誀恳泄切纬傻鞍祝╞one morphogenetic protein，BMP）對(duì)擴(kuò)張骨縫作用，本研究建立了犬腭橫縫牽引模型，探討當(dāng)牽引力大于800g后加入緩釋rhBMP－2對(duì)骨質(zhì)改建的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取4～5個(gè)月健康雜種犬36只，體質(zhì)量（3.72±1.35）kg，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。牽引器：由不銹鋼滑道和作用距離為30mm（初始作用力為400、600、800 g）的形狀鎳鈦記憶合金組成，由北京有色金屬研究所提供。內(nèi)水相：rhBMP－2 10mg加入適量鹽酸胍溶液溶解后，取100μL與少量牛血清清蛋白混勻形成，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；油相：聚乳酸－羥基乙酸共聚物（poly lactic－co－glycolic acid，PLGA），由山東醫(yī)療器械研究所提供；外水相：含1%PVA聚乙烯醇、0.5%吐溫－20，由北京化學(xué)試劑公司提供。纖維蛋白膠（fibrin sealant，F(xiàn)S），由杭州普濟(jì)公司提供；兔抗鼠 BMP－2、BMP－4、BMP－7多克隆抗體，由博士德公司提供；生物素化山羊抗兔IgG，由博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 rhBMP－2緩釋膠囊制作 將初乳與10mL外水相經(jīng)800r／min離心4h，過濾，蒸餾水洗滌，真空凍干，形成rhBMP－2／PLGA緩釋微球，4～8℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別將緩釋微球與FS的主體膠和粉劑相溶，制成主體膠混懸液和催化劑溶液。二者按1∶1比例通過雙管注射器于術(shù)后5d注入牽引區(qū)附近黏膜下。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及手術(shù)操作 將36只健康雜種犬隨機(jī)分為對(duì)照組（n＝4）和實(shí)驗(yàn)組（32）只，實(shí)驗(yàn)組又分為400g組（n＝8）、600g組（n＝8）、800g組（n＝8）、800g＋rhBMP－2組（聯(lián)合組）（n＝8）。實(shí)驗(yàn)組采用3%戊巴比妥鈉（0.1mg／kg）靜脈注射麻醉，術(shù)前15min阿托品0.01mg／kg肌內(nèi)注射，先截除尖牙牙冠后行根管治療。無菌條件下在硬腭中線縱行6cm切口，剝離子翻瓣，找到腭橫縫后，電鉆鉆孔將滑道后板用微型螺釘固定于腭橫縫后緣。在腭橫縫前測(cè)量相應(yīng)位置后鉆孔，分別固定400、600、800g鎳鈦合金絲及滑桿。鎳鈦合金固定于腭橫縫兩側(cè)，通過滑道限制牽引絲擴(kuò)張方向，可以將兩側(cè)骨板按預(yù)定軌跡相背移動(dòng)。牽引5d后通過雙管注射器將rhBMP－2／PLGA緩釋微球與FS注入聯(lián)合組動(dòng)物的牽引區(qū)黏膜下。對(duì)照組不處理。術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素40萬μ，共4d。每周拍X線片，以確定上頜骨位移及牽引器固定情況。

1.2.3 標(biāo)本采集及制作 術(shù)后1、2、4、8周以過量麻藥處死各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物2只，對(duì)照組1只。先行頭顱CT橫斷掃描，掃描區(qū)間自外耳道至尖牙區(qū)。解剖腭骨剔除軟組織后，組織塊固定于10%中性甲醛中，5.5%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣3周，脫水、包埋。免疫組織化學(xué)染色60℃烤片過夜，一抗采用兔抗鼠BMP－2、BMP－4、BMP－7多克隆抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。按說明書完成免疫組織化學(xué)染色，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，各組間比較行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床觀察 術(shù)中800g組1只犬死亡，給予補(bǔ)充，余均健康，牽引器固定完好。各組術(shù)后顱底上牙槽座角（∠SNA）自131°增大至140°±4°（表1）。顱底下牙槽座角（∠SNB）無明顯變化，維持在128°左右，各標(biāo)志點(diǎn)見圖1、2。為排除其他影響因素，解剖顱骨標(biāo)本后按Yao等［4］顱骨各標(biāo)志點(diǎn)以游標(biāo)卡尺（E0512）測(cè)量（圖3），結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組上頜成功前徙，以600g及聯(lián)合組明顯（表2）。頭顱CT掃描顯示，各牽引組腭骨水平板均變薄，骨密度顯著下降，以800g組（圖4）明顯，在注射rh－BMP－2后（圖5）明顯改善，見表3。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 BMP－2（圖6）、BMP－4（圖7）、BMP－7（圖8）陽性染色主要定位于成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞以形態(tài)學(xué)鑒定，其中成骨細(xì)胞染色較深。經(jīng)Image pro plus軟件的intensity校正及測(cè)量過濾分析，BMP－2、BMP－4 的 累 積 光 密 度 值 （integrated optical density，IOD）值在2周內(nèi)達(dá)到峰值，之后逐漸下降至正常水平。BMP－7則處于低表達(dá)狀態(tài)，但800g在注射rhBMP－2后有所增強(qiáng)，見表4～6。

圖1 400g組牽引2周頭影測(cè)量及各標(biāo)志點(diǎn)

圖2 600g組牽引2周頭影測(cè)量及各標(biāo)志點(diǎn)

表1 各組∠SNA、∠SNB測(cè)量結(jié)果比較（

表2 各組上頜骨前移結(jié)果比較（±s，mm）

表2 各組上頜骨前移結(jié)果比較（±s，mm）

OI：枕髁中點(diǎn)與中切牙頸部中點(diǎn)距離；OC：枕髁中點(diǎn)與尖牙頸部中點(diǎn)距離；DD：腭橫縫兩側(cè)固定螺釘間距離；－：此項(xiàng)無數(shù)據(jù)。

組別 n OI OC DD 4 1.0±0.2 0.8±0.1 － － －400g組 8 16.6±2.8 16.1±2.8 17.8±4.0 0.42 ＜0.05 600g組 8 25.3±5.2 19.5±3.3 22.9±5.2 1.21 ＜0.05 800g組 8 12.1±2.3 12.5±4.9 12.5±2.4 1.46 ＞0.05聯(lián)合組 8 24.2±3.4 23.8±4.6 23.8±4.2 1.28 ＜t P對(duì)照組0.05

表3 CT檢測(cè)各組腭骨水平板骨密度值比較（±s，HU）

表3 CT檢測(cè)各組腭骨水平板骨密度值比較（±s，HU）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組同時(shí)間比較。

時(shí)間 對(duì)照組（n＝4） 400g組（n＝8） 600g組（n＝8） 800g組（n＝8） 聯(lián)合組（n＝8）第1周 1 235.6±96.0 881.5±81.9 724.7±99.0 294.3±240.7＊892.9±86.6第2周 1 255.7±109.3 929.4±103.3 715.8±84.9 317.8±185.5＊ 1 001.8±95.4第4周 1 260.9±88.3 911.9±71.6 759.6±90.9 349.0±181.0＊ 1 060.7±79.1第8周 1 235.1±100.2 930.9±75.4 839.0±92.0 377.9±160.0＊1 158.0±93.0

圖3 牽引器固定位置及各標(biāo)志點(diǎn)

圖4 800g組牽引8周后腭骨水平板密度圖像

圖5 聯(lián)合組（8周）腭骨水平板骨密度圖像

圖6 400g組牽引2周時(shí)BMP－2細(xì)胞形態(tài)（箭頭示成骨細(xì)胞，×200）

圖7 600g組牽引4周時(shí)BMP－4細(xì)胞形態(tài)（箭頭示成纖維細(xì)胞，×400）

圖8 800g組牽引8周時(shí)BMP－7細(xì)胞形態(tài)（箭頭示骨細(xì)胞，×200）

表4 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－2IOD值結(jié)果（±s）

表4 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－2IOD值結(jié)果（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別 n 1周 2周 4周 8周45.0 18 725.0±2 027.0 400g組 8 24 055.0±2 827.0 32 917.0±2 164.0 21 803.0±2 908.0 19 316.0±1 308.0 600g組 8 35 100.0±2 069.0＊ 61 119.0±3 182.0＊ 29 507.0±2 508.0 20 135.0±2 128.0 800g組 8 36 463.0±3 159.0＊ 81 604.0±3 425.0＊ 20 457.0±2 217.0 17 076.0±2 015.0聯(lián)合組 8 62 337.0±3 274.0＊ 99 038.0±4 825.0＊ 38 546.0±3 275.0＊對(duì)照組 4 19 867.0±1 725.0 20 390.0±1 842.0 19 231.0±1 8 32 082.0±2 541.0

表5 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－4IOD值結(jié)果（±s）

表5 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－4IOD值結(jié)果（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別 n 1周 2周 4周 8周36.0 18 925.0±2 342.0 400g組 8 24 045.0±2 168.0 31 806.0±2 049.0 21 937.0±3 725.0 20 715.0±2 457.0 600g組 8 35 009.0±3 046.0＊ 61 008.0±2 684.0＊ 30 782.0±2 557.0 21 483.0±2 506.0 800g組 8 38 451.0±3 846.0＊ 81 572.0±2 973.0＊ 20 663.0±1 976.0 17 626.0±1 685.0聯(lián)合組 8 77 832.0±4 145.0＊ 43 479.0±3 016.0＊對(duì)照組 4 17 684.0±1 513.0 18 346.0±2 026.0 17 432.0±1 7 29 845.0±2 160.0 21 974.0±2 827.0

表6 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－7IOD值結(jié)果（±s）

表6 各組免疫組織化學(xué)染色BMP－7IOD值結(jié)果（±s）

組別 n 1周 2周 4周 8周57.0 24 989.0±2 108.0 400g組 8 11 327.0±2 150.0 15 395.0±1 957.0 21 145.0±2 052.0 26 703.0±1 827.0 600g組 8 12 598.0±1 846.0 18 668.0±2 017.0 21 478.0±2 072.0 28 167.0±1 974.0 800g組 8 13 415.0±1 268.0 17 167.0±2 249.0 15 786.0±1 618.0 24 816.0±1 853.0聯(lián)合組 8 23 740.0±1 827.0 26 179.0±2 035.0 27 103.0±2 6對(duì)照組 4 27 341.0±3 127.0 24 586.0±2 826.0 25 573.0±1 9 39.0 25 704.0±1 893.0

3 討 論

牽引成骨術(shù)已廣泛應(yīng)用于顱頜面畸形治療，尤其是頜骨畸形較重，正頜手術(shù)無法達(dá)到預(yù)期效果的患者。缺點(diǎn)是存在截骨創(chuàng)傷及較長(zhǎng)治療期，這對(duì)患者均有一定心理上影響［5－6］。21世紀(jì)初，有研究先后提出采用經(jīng)骨縫牽引修復(fù)頜骨畸形的觀點(diǎn)，無需截骨，創(chuàng)傷減小，在臨床上也取得了較好的治療效果［7－9］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期成果［10］，利用鎳鈦合金形狀記憶特性制作“M”形牽引絲，通過滑道后板及滑桿固定于腭橫縫兩側(cè)，以限制牽引絲擴(kuò)張方向，使上頜骨按預(yù)定軌跡相背移動(dòng)，自行擴(kuò)張骨縫。手術(shù)植入牽引器僅需10～20min，操作簡(jiǎn)化。各標(biāo)志點(diǎn)測(cè)量結(jié)果顯示，顱底∠SNA隨牽引逐漸增大，顱底∠SNB沒有改變。說明新研制牽引器能有效前移上頜骨復(fù)合體，沒有扭轉(zhuǎn)頜骨等不良結(jié)果。但骨縫牽引仍有牽引成骨缺點(diǎn)即治療周期長(zhǎng)，往往需要6個(gè)月甚至1年以上固定期。為縮短治療期，本研究試用3種不同牽引力，期望找到最佳力值，即可快速擴(kuò)張骨縫，又不致因力值過大造成對(duì)骨縫不可復(fù)性損傷。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)牽引力越大，上頜骨前移越明顯，但超過800g后上頜骨前期前徙雖然較快，后期明顯減慢。CT檢測(cè)也顯示800g組骨密度值降低明顯（317.8±185.5）HU，因此，本研究認(rèn)為，當(dāng)牽引力大于800g后對(duì)生長(zhǎng)期犬骨縫有一定損傷，甚至影響其后期生長(zhǎng)發(fā)育。為達(dá)到快速牽引目的，在采用800g牽引力同時(shí)加入rhBMP－2，以改善因機(jī)械力過大對(duì)骨縫及周圍組織的負(fù)面影響。結(jié)果表明，∠SNA并未因采用800g力而減小，上頜骨平均前徙距離也超過600g，平均骨密度值也明顯增高。說明rhBMP－2在促進(jìn)骨形成，修復(fù)因過大牽引力對(duì)骨縫組織損傷方面起到重要作用。

機(jī)械牽引力可以刺激和保持骨組織再生與生長(zhǎng)，在這個(gè)過程中各種生長(zhǎng)因子起到至關(guān)重要作用，其中BMP是公認(rèn)的最重要調(diào)節(jié)因子之一［11－12］。免疫組織化學(xué)染色顯示 BMP－2、BMP－4陽性染色主要定位在成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，于牽引2周內(nèi)達(dá)到峰值，以800g組增高明顯。說明牽引力與BMP－2、BMP－4的活性相關(guān)，牽引力越大，活性越強(qiáng)。同時(shí)也說明這些細(xì)胞的BMP－2、BMP－4受體在整個(gè)牽引期處于活躍狀態(tài)。2周后IOD值則急劇下降，可能是彈性牽引力已大幅下降，如需繼續(xù)延長(zhǎng)骨長(zhǎng)度，則需要更換牽引器。BMP－7染色一直處于低表達(dá)狀態(tài)，在注射rhBMP－2后表達(dá)明顯增強(qiáng)。說明rhBMP－2不僅可單獨(dú)促進(jìn)骨質(zhì)改建，而且有調(diào)節(jié)BMP－7表達(dá)的作用。

骨質(zhì)改建是一個(gè)精確平衡過程，控制或改變?nèi)我灰蛩亟杂锌赡軐?dǎo)致骨量的增加［13］。針對(duì)經(jīng)骨縫牽引成骨治療周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，本研究選擇了力值較大的800g牽引力以加快牽引進(jìn)程，同時(shí)注入促進(jìn)骨質(zhì)生成的rhBMP－2，以對(duì)抗機(jī)械力過大造成骨縫損傷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

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