巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換在NAFLD發(fā)生過程中的可能作用＊

邵小娟，王曉敏，王 斌，熊 吉，李 青，陳東風△

（1.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所消化內(nèi)科，重慶400042；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院干部保健中心，新疆烏魯木齊830000）

非酒精性脂肪性肝?。╪on－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其病理學改變與酒精性肝?。ˋLD）相似，但患者無過量飲酒史，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關(guān)肝硬化和肝細胞癌。NAFLD是21世紀全球重要的公共健康問題之一，亦是中國愈來愈重視的慢性肝病。有學者近年來研究認為，NAFLD患者存在全身低度炎癥狀態(tài)，在NAFLD中的NASH及此后進展階段更為明顯，與疾病演進關(guān)系密切［1］。巨噬細胞是炎癥過程中的關(guān)鍵細胞。學者們既往重視它與肝臟炎癥及腫瘤發(fā)生中的作用，關(guān)于其在NAFLD的形成及進展中的相關(guān)研究較少。

巨噬細胞參與了體內(nèi)的固有免疫和獲得性免疫［2］。激活的巨噬細胞將會釋放細胞因子及炎癥趨化因子來抵御感染及修復(fù)組織［3］。有研究表明，脂肪組織的巨噬細胞在與肥胖相關(guān)的慢性疾?。ㄈ?型糖尿病和心血管疾病）中起到了至關(guān)重要的作用［4］。脂肪組織的巨噬細胞存在不同的表型，1型輔助性T細胞（Th1）通過產(chǎn)生白細胞介素（IL）－2、干擾素－γ（IFN－γ）、腫瘤壞死因子（TNF）等細胞因子，誘導巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換為M1亞群巨噬細胞，引起細胞免疫和炎癥；2型輔助性T細胞（Th2）細胞通過產(chǎn)生IL－4，IL－13，誘導 M2亞群巨噬細胞，減輕炎癥的發(fā)生［5］。本文對巨噬細胞及其功能轉(zhuǎn)換在NAFLD疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用和意義進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2012年4～10月在第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所診斷的NAFLD伴單純性膽囊結(jié)石、非NAFLD伴單純性膽囊結(jié)石，且年齡為18～60歲的患者納入分析。NAFLD的診斷標準符合2010年中華醫(yī)學會制定的NAFLD診療指南中的標準［6］：（1）無飲酒史或飲酒折合乙醇量小于140g／周（女性，＜70g／周）；（2）除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆狀核變性、自身免疫性肝病等可導致脂肪肝的特定疾??；（3）肝活檢組織學改變符合脂肪性肝病的病理學診斷標準；（4）肝臟影像學表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝的診斷標準且無其他原因可供解釋；（5）有代謝綜合征相關(guān)組分的患者出現(xiàn)不明原因的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和（或）天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）持續(xù)增高6個月以上。減肥和改善IR后，異常酶譜和影像學脂肪肝改善甚至恢復(fù)正常者。明確為NAFLD的患者27例（NAFLD組），男10例，女17例；排除NAFLD及其他一切肝病，且肝功能正常的單純性膽囊結(jié)石患者28例（非NAFLD組），男5例，女23例。所有納入研究患者均簽署知情同意書，倫理中心備案。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 登記患者姓名、住院號、年齡、性別、BMI、腹圍。肝組織標本、網(wǎng)膜脂肪及皮下脂肪在獲得患者知情同意后通過腹腔鏡手術(shù)獲得，網(wǎng)膜脂肪從鄰近膽囊的大網(wǎng)膜獲得，皮下脂肪從上腹部的腹壁脂肪獲得。

1.2.2 實驗室檢測 所有研究對象均于禁食飲水12h后，于入院次日清晨抽取肘靜脈血。采用全自動生化分析儀測定如下血液學指標：血糖、ALT、AST、總膽紅素（TB）、胰島素、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（FFA），并計算胰島素抵抗指數(shù)（HO－MA－IR，即空腹血糖×空腹胰島素／22.5）。

1.2.3 免疫組織化學檢測 將皮下脂肪及網(wǎng)膜脂肪分別在甲醛中嵌塊包埋，切成5μm厚的薄切片，脫蠟后抗原的修復(fù)在乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid buffer，EDTA）（pH 9.0）中進行，用微波爐加熱8min，然后初級抗體反應(yīng)CD11c（1∶100，clone EP1347Y，Abcam，Cambridge，Massachusetts），CD206（1∶1 500，clone 5C11，Abnova，Taipei，Taiwan），和 CD68（1∶100，clone KP－1，Dako，Glostrup，Denmark），在4℃冰箱中孵育過夜，接著通過二次抗體（PV2000，中杉金橋）在37℃培育。定位的二次抗體通過有蘇木素的抗復(fù)染色劑觀察，巨噬細胞的計數(shù)在×200的視野下取任意3個視野計數(shù)?？笴D68免疫組織化學標記巨噬細胞，抗CD11C和抗CD206分別標記M1、M2亞群巨噬細胞［7］。

1.2.4 NAFLD活動度積分（NAFLD activity score，NAS）評分 評估NAFLD的嚴重程度，本研究采用病理診斷及NAS。標準采用美國國立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南中的標準，NAS積分范圍為0～8分，（1）肝細胞脂肪變：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（＞33%～66%）；3分（＞66%）；（2）小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡計數(shù)壞死灶）：0分（無）；1分（＜2個）；2分（2～4個）；3分（＞4個）；（3）肝細胞氣球樣變：0分（無）；1分（少見）；2分（多見）。肝纖維化評估則采用定性診斷，0分：無肝纖維化；1分：存在肝纖維化。NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分則可診斷NASH，介于二者之間為NASH可能。規(guī)定不伴有小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和纖維化但肝脂肪變大于33%者為NAFL，脂肪變達不到此程度者僅稱為肝細胞脂肪變［8］。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（25%，75%分位數(shù)）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分比，組間比較用χ2檢驗，相關(guān)分析用線性相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基本特征比較 NAFLD組與非NAFLD患者比較，在年齡、腹圍、血糖、ALT、AST、TB、FFA，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），NAFLD組與非 NAFLD組FFA為0.97（0.05，2.28）mmol／L vs.0.94（0.73，2.16）mmol／L（P＝0.556）；而BMI、胰島素、TG、HOMA－IR較非 NAFLD組患者升高（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者基本特征比較（±s）

表1 兩組患者基本特征比較（±s）

項目 NAFLD組（n＝27） 非NAFLD組（n＝28）P 46.89±9.91 47.11±8.67 0.931 BMI 24.49±3.07 22.53±2.67 0.049腹圍（cm） 82.37±6.34 82.32±5.13 0.975血糖（mmol／L） 5.64±1.44 5.43±1.23 0.575 ALT（U／L） 36.77±26.97 27.85±18.18 0.155 AST（U／L） 29.86±13.99 23.68±9.64 0.061 TB（mol／L） 14.38±4.32 13.88±4.69 0.683 TG（mol／L） 2.39±0.75 1.65±0.47 0.000胰島素（U／mL） 84.10±38.47 51.15±32.12 0.010年齡（歲）HOMA－IR 22.61±16.75 12.43±10.66 0.050

圖1 巨噬細胞在NAFLD組患者網(wǎng)膜脂肪及皮下脂肪的免疫組織化學染色（×200）

圖2 巨噬細胞在非NAFLD組患者網(wǎng)膜脂肪及皮下脂肪的免疫組織化學染色（×200）

2.2 網(wǎng)膜及皮下脂肪巨噬細胞免疫組織化學染色 NAFLD組免疫組織化學染色可見皮下的CD68陽性染色細胞少于網(wǎng)膜，皮下的CD11C及CD206陽性染色細胞均較網(wǎng)膜少（圖1）。非NAFLD組也可見同樣的趨勢（圖2）。與非NAFLD組比較，NAFLD組的CD68、CD11C及CD206陽性染色數(shù)量均較非NAFLD組增加。

2.3 兩組患者網(wǎng)膜、皮下脂肪巨噬細胞及M1、M2亞群細胞巨噬細胞數(shù)量比較 NAFLD組網(wǎng)膜、皮下脂肪的巨噬細胞多于非NAFLD組，NAFLD組網(wǎng)膜脂肪巨噬細胞數(shù)量的均值為（41.50±10.47）個，皮下脂肪巨噬細胞數(shù)量的均值為（26.55±10.74）個；非NAFLD組網(wǎng)膜脂肪巨噬細胞數(shù)量的均值為（29.93±11.49）個，皮下脂肪巨噬細胞數(shù)量的均值為（15.57±5.67）個，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。在NAFLD組中，皮下、網(wǎng)膜脂肪及M1、M2亞群巨噬細胞的數(shù)量都同時增加，以M1亞群巨噬細胞增加更為明顯（P＜0.05）。

2.4 在NAFLD組中M1、M2亞群巨噬細胞的數(shù)量與NAS評分的相關(guān)性 對NAFLD患者的肝臟損害進行NAS評分，27例NAFLD患者中，7分的1例，6分4例，5分7例，4分3例，3分7例，2分4例，1分1例。NAFLD患者網(wǎng)膜及皮下脂肪中巨噬細胞與NAS評分的相關(guān)性見表3。

表2 兩組患者皮下及網(wǎng)膜脂肪巨噬細胞比較（±s）

表2 兩組患者皮下及網(wǎng)膜脂肪巨噬細胞比較（±s）

組別 n 皮下CD68 網(wǎng)膜CD68 皮下CD206 網(wǎng)膜CD206 皮下CD11C 網(wǎng)膜CD11C 皮下CD11C／CD206 47 4.18±1.98 8.17±4.39 0.45±0.16 0.42±0.20 NAFLD組 27 26.55±10.74 41.50±10.47 15.22±6.74 21.15±11.25 9.93±4.51 14.52±3.62 0.66±0.23 0.59±0.27 P 0.000 0.000 0.000 0.634 0.000 0.000 0.000 0.007 CD206非NAFLD組 28 15.57±5.67 29.93±11.49 9.6±3.55 19.86±8.網(wǎng)膜CD11C／

表3 NAFCD組患者NAS評分與網(wǎng)膜及皮下脂肪中巨噬細胞的相關(guān)性

2.5 肝細胞脂肪變、炎癥、氣球樣變及纖維化的相關(guān)性 分析結(jié)果提示網(wǎng)膜脂肪的 M1與脂肪變密切相關(guān)（r＝0.459，P＜0.05），皮下脂肪的 M1與脂肪變、炎癥、氣球樣變及纖維化密切相關(guān)（r＝0.447、r＝0.412、r＝0.504，r＝0.470，P＜0.05），皮下脂肪的巨噬細胞數(shù)量與肝臟的脂肪變、氣球樣變及纖維化密切相關(guān)（r＝0.408、r＝0.403、r＝0.434，P＜0.05）。

3 討 論

NAFLD發(fā)病機制以“二次打擊”學說被廣泛接受，IR是“一次打擊”的核心，肝細胞脂肪代謝異常，肝臟內(nèi)脂肪沉積，尤其是TG沉積是第一次打擊的直接后果。本研究對人群資料分析發(fā)現(xiàn)，NAFLD組患者BMI、胰島素、TG、HOMA－IR升高，說明了NAFLD患者往往合并了IR及血脂紊亂，這些結(jié)果符合NAFLD發(fā)生的“一次打擊”學說［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD患者中，肝組織標本出現(xiàn)不同程度的肝細胞腫脹、炎癥和纖維化，部分表現(xiàn)出NASH的特征，出現(xiàn)NAFLD的“二次打擊”［10］。既往并未重視巨噬細胞在此過程中的變化和作用，本研究主要關(guān)注了巨噬細胞及巨噬細胞亞群數(shù)量的變化與NAFLD患者肝臟炎癥的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD患者中，巨噬細胞、M1亞型巨噬細胞、M2亞型巨噬細胞及M1／M2在皮下脂肪組織及網(wǎng)膜脂肪組織中都明顯升高。對NAFLD患者的數(shù)據(jù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，皮下脂肪的CD68、CD11C及CD206陽性細胞都與NAS評分呈正相關(guān)，同時網(wǎng)膜脂肪的CD68，CD11C陽性細胞也與NAS評分呈正相關(guān)，提示巨噬細胞及其亞型與NAFLD的嚴重程度有密切關(guān)系。從另一方面提示NAFLD是一種全身慢性炎癥疾病，而脂肪組織的炎癥是全身炎癥反應(yīng)中易被忽略的炎癥形式，在炎癥過程中的巨噬細胞發(fā)揮著重要的作用。

本文結(jié)果表明，無論是網(wǎng)膜脂肪還是皮下脂肪的M1亞群巨噬細胞的數(shù)量都與肝組織炎癥及脂肪變有一定關(guān)系，提示M1亞群巨噬細胞參與了NAFLD脂肪變的發(fā)生，可能與M1亞群巨噬細胞分泌脂代謝相關(guān)細胞因子，如TNF－α、IL－6等，TNF－α介導氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷，對肝細胞的毒性增強，誘發(fā)線粒體代謝障礙，從而進一步加劇肝細胞發(fā)生脂肪變性、炎性反應(yīng)、壞死甚至纖維化。IL－6可刺激脂肪動員，促進FFA釋放，使血液循環(huán)中的TG異常增多，從而脂質(zhì)在肝臟堆積，導致脂肪變。由此可見巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)換參與了NAFLD的多個環(huán)節(jié)。

在NAFLD患者中，人們往往重視內(nèi)臟脂肪的作用而忽視了皮下脂肪的作用，本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD患者中，皮下脂肪與內(nèi)臟脂肪同樣與肝細胞脂肪變、肝臟炎癥及NAFLD的嚴重程度密切相關(guān)。有學者們研究表明，在冠心病中患者的心外膜脂肪的巨噬細胞數(shù)量增加，而皮下脂肪的巨噬細胞無明顯增加，并且在冠心病患者中，M1／M2比值與冠心病嚴重程度呈正比［8］，該研究與本研究結(jié)果類似，但冠心病患者皮下脂肪的巨噬細胞無明顯變化，說明了冠心病患者的全身炎癥不重，而本組資料中發(fā)現(xiàn)NALFD患者皮下脂肪中的巨噬細胞、M1亞型巨噬細胞及M2亞型巨噬細胞數(shù)量明顯增加，可能是因為NAFLD患者的全身低度炎癥反應(yīng)所導致。在動物實驗的研究中，發(fā)現(xiàn)在NAFLD中Th1免疫反應(yīng)起主要作用，促進了kupffer細胞的M1激活［11］。大鼠中Kuppfer細胞的 M1激活對肝臟的脂肪變有促進作用［12］。最新研究表明，在NASH大鼠中，脂肪組織巨噬細胞存在表型轉(zhuǎn)換［13］，M1／M2與NASH的嚴重程度相關(guān)［14］，此結(jié)果在本研究中得到了進一步證實。因此，臨床上是否可以將皮下脂肪的巨噬細胞數(shù)量作為預(yù)測NAFLD嚴重程度指標值得進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在NAFLD患者網(wǎng)膜及皮下脂肪組織中巨噬細胞及其表型轉(zhuǎn)換參與了NAFLD的發(fā)生及發(fā)展過程，皮下脂肪活檢檢測巨噬細胞可否作為NAFLD的嚴重程度的判斷指標需進一步深入研究。

［1］ 張學力，郗光霞，趙媛媛，等.胰島素抵抗與非酒精性脂肪性肝?。跩］.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2012，32（1）：59－61.

［2］ Mantovani A，Biswas SK，Galdiero MR，et al.Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodeling［J］.J Pathol，2013，229（2）：176－185.

［3］ 況曉東，周曉燕，艾有生.巨噬細胞極化與代謝性疾病的研究進展［J］.實用臨床醫(yī)學，2012，13（4）：123－125，129.

［4］ Shoelson SE，Herrero L，Naaz A.Obesity，inflammation，and insulin resistance［J］.Gastroenterology，2007，132（6）：2169－2180.

［5］楊洋.巨噬細胞在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用研究進展［J］.重慶醫(yī)學，2011，40（15）：1532－1534.

［6］ 中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2006，14（3）：161－163.

［7］ Hirata Y，Tabata M，Kurobe H，et al.Coronary atherosclerosis is associated with macrophage polarization in epicardial adipose tissue［J］.J Am Coll Cardiol，2011，58（3）：248－255.

［8］ Kleiner DE，Brunt EM，Van Natta M，et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease［J］.Hepatology，2005，41（6）：1313－1321.

［9］ 李娟，葉菲.非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制的研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2011，38（5）：341－344.

［10］王萬東，陳東風.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激線粒體功能紊亂與非酒精性脂肪性肝?。跩］.重慶醫(yī)學，2009，38（4）：423－424.

［11］Neyrinck AM，Cani PD，Dewulf EM，et al.Critical role of Kupffer cells in the management of diet－induced diabetes and obesity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，385（3）：351－356.

［12］Rivera CA，Adegboyega PA，van Rooijen N，et al.Tolllike receptor－4signaling and Kupffer cells play pivotal roles in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis［J］.J Hepatol，2007，47（4）：571－579.

［13］Oh DY，Morinaga H，Talukdar S，et al.Increased macrophage migration into adipose tissue in obese mice［J］.Diabetes，2012，61（2）：346－354.

［14］Maina V，Sutti S，Locatelli I，et al.Bias in macrophage activation pattern influences non－alcoholic steatohepatitis（NASH）in mice［J］.Clin Sci，2012，122（11）：545－553.