吸入性麻醉藥對促炎性細胞因子表達的影響

李 江，李麗莎

（云南省第一人民醫(yī)院麻醉科／昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，昆明650031）

嚴(yán)重創(chuàng)傷，重大手術(shù)創(chuàng)傷、休克、感染、臟器缺血再灌注損失、內(nèi)毒素血癥是圍術(shù)期常見的現(xiàn)象。圍術(shù)期過激炎癥反應(yīng)的調(diào)控近年來一直是重點研究領(lǐng)域，眾多在體及離體的研究顯示吸入麻醉藥可明顯減少心、腦、肺、肝、腎等器官的損傷，保護臟器功能［1－3］，其機制較復(fù)雜，涉及很多方面。其中，異氟醚為目前臨床最常用的吸入麻醉藥物之一，其對炎性因子的影響一直存在爭議。因此，本研究觀察了吸入麻醉藥異氟醚對大鼠促炎性細胞因子表達的影響，旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇成年雄性Lewis大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～250g，由上海史萊克動物提供商供應(yīng)，于上海實驗動物中心（SPF級）預(yù)檢3d，一籠飼養(yǎng)4只，動物室和實驗室溫度為23℃，12h明暗輪流光照，自由飲食。異氟醚（isoflurane）（河北九派制藥有限公司），脂多糖（Sigma公司），生理鹽水（山東華魯制藥有限公司），牛胎兒血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），戊巴比妥鈉，5mL離心管，15mL離心管，2mL的一次性注射器，針頭（16G），Narcomed 2B麻醉機（Drager公司），有機玻璃麻醉箱（40cm×30cm×30cm）購于北京有機玻璃廠，多功能氣體檢測儀（Datex－Ohmeda，芬蘭），大鼠白細胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、干擾素（interferon－gamma，IFN－γ）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor－alpha，TNF－α）、ELISA 試劑盒（博士德公司），Trizol RNA 分離液（美國Promega公司），RT－PCR試劑盒（美國Promega公司），甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、TNF－α 引 物（Invitrogen公司），細胞計數(shù)儀 Vi－cellXR（美國 Beckman Coulter），大鼠固定器。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將24只Lewis大鼠采用隨機數(shù)字法隨機分為3組：正常組、對照組、異氟醚組，每組8只。除正常組之外，其余組均放入密閉有機玻璃麻醉箱內(nèi)，進氣端與麻醉機呼吸回路相連通，出氣端接多功能氣體檢測儀并與大氣相通。氧氣濃度維持在40%，大鼠保持自主呼吸，容器內(nèi)溫度維持在（23.00±1.00）℃，濕度為（50.00±10.00）%；在此基礎(chǔ)上，異氟醚組分別吸入2%的異氟醚。多功能氣體檢測儀監(jiān)測容器內(nèi)異氟醚濃度和氧氣濃度，達到設(shè)定值（40%O2、2%異氟醚）后即使開始計時。

1.2.2 動物急性炎癥模型制備 大鼠在吸入2%的異氟醚后30min尾靜脈注射一次脂多糖（5mg／kg）。

表1 3組大鼠BALF中各種炎癥細胞數(shù)量比較（個，×103，±s）

表1 3組大鼠BALF中各種炎癥細胞數(shù)量比較（個，×103，±s）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

組別 n 巨噬細胞 嗜酸性粒細胞 中性粒細胞 淋巴細胞 總數(shù)正常組 8 114.80±85.25 120.09±156.46 0.86±0.86 1.93±0.34 237.67±237.79對照組 8 141.24±27.76 201.20±47.64 1 387.08±254.48 7.99±1.68 1 737.50±304.22異氟醚組 8 129.82±44.20 157.44±41.02 6.43±3.84＊ 2.56±0.73＊ 296.25±78.94＊

表2 3組大鼠BALF和血清中 TNF－α、IL－2和INF－γ表達（n＝8，±s，pg／mL）

表2 3組大鼠BALF和血清中 TNF－α、IL－2和INF－γ表達（n＝8，±s，pg／mL）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

組別 n BALF TNF－αmRNA TNF－α血清IL－2 INF－γ正常組 8 0.70±0.19 143.79±4.69＊ 192.44±96.68＊ 10.67±10.67＊對照組 8 1.53±0.49 2 717.30±245.49 6 690.67±530.25 412.78±109.01異氟醚組 8 1.23±0.26＊ 758.63±65.76＊ 2 995.22±419.41＊ 217.25±10.50＊

1.2.3 標(biāo)本采集 脂多糖靜脈注射之前給予30min異氟醚，4h之后，將大鼠麻醉（12mg／mL戊巴比妥鈉，5mL／kg），心臟采血收集，然后在氣管上開一小口，將針頭（16G針頭）插入氣管內(nèi)，用止血鉗固定，用5mL含1%FBS的PBS液清洗支氣管及肺泡3次，如此3遍，共用15mL的支氣管灌流液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）沖洗。腹主動脈采血并以12 000r／min離心5min取上清液做ELISA檢測IL－2和IFN－γ。將BALF以1 500r／min離心10min，上清液分裝置－80℃保存以測定細胞因子（TNF－α），下層細胞用PBS＋1%FBS懸?。s106／mL），取100μL的細胞懸液，800r／min離心5 min，涂片，晾干，甲醛固定，然后用瑞士－吉姆薩染液，A液染3 min，B液染10min，不同種類細胞計數(shù)。最后分離取出肺組織中右上肺做RT－PCR檢測TNF－α表達水平。

1.2.4 檢測指標(biāo) 對BALF中的炎癥細胞進行細胞計數(shù)，以及應(yīng)用ELISA檢測BALF和血漿中的促炎細胞因子（TNF－α、IL－2、IFN－γ）含量。

1.2.5 RT－PCR法檢測TNF－αmRNA表達水平 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20μL體系）；PCR擴增（25μL體系），引物序列為：TNF－α上游引物5′－CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C－3′，TNF－α下游引物5′－CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T－3′，產(chǎn)物長度546bp；GAPDH 上游引物5′－CAC GGC AAG TTC AAT GGC ACA－3′，下游引物5′－GAA TTG TGA GGG AGA GTG CTC－3′，產(chǎn)物長度970bp。產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，用EB染色，圖像采用Quantity One v462凝膠定量分析軟件進行分析，以TNF－α與GAPDH擴增條帶灰度比值進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用Graphpad prism軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Turkey檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3組大鼠BALF中各種炎癥細胞數(shù)量見表1，3組大鼠BALF中TNF－α的表達和大鼠血清中IL－2和INF－γ的含量見表2。

3 討 論

脂多糖是一個大分子由脂質(zhì)和多糖價鍵相連組成，是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分，被充當(dāng)內(nèi)毒素，并在動物中引起強烈的免疫反應(yīng)，同時也是免疫和炎癥系統(tǒng)中的主要激活物，包括巨噬細胞、單核細胞和內(nèi)皮細胞。它能導(dǎo)致敗血性休克、炎癥發(fā)生、多種器官損傷和細胞因子的釋放。

麻醉藥物對機體免疫功能的影響已被越來越多的實驗所證實。其作用可能是通過對機體應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細胞因子的相互作用及對細胞表面受體和離子通道的影響而引起的。麻醉藥物可直接作用于炎癥細胞（如影響自然殺傷細胞、單核細胞－巨噬細胞、粒細胞的數(shù)目或功能），也可以通過影響炎癥介質(zhì)，包括細胞因子，而起到促進或抑制炎性作用，其中細胞因子在麻醉藥物作用中所處的地位日益受到重視。

TNF－α、IL－2和INF－γ都是目前研究最為活躍的促炎細胞因子，它們由炎癥細胞激活所釋放，能引起強烈的炎癥反應(yīng)。T－和B－淋巴細胞的激活將會導(dǎo)致IL－2的釋放，IL－2與其受體結(jié)合誘導(dǎo)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，引起免疫缺陷或自身免疫性疾病。INF－γ具有免疫調(diào)節(jié)作用，是一個病毒復(fù)制的抑制物，同時也是Th1淋巴細胞及其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的標(biāo)志。TNF－α主要由單核－巨噬細胞分泌，在體內(nèi)外均能刺激IL－1的產(chǎn)生。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，吸入性麻醉藥物異氟醚能夠影響TNF－α、IL－2和INF－γ的表達，減少它們的產(chǎn)生。這說明吸入性麻醉藥物有可能改變手術(shù)或炎癥產(chǎn)生的促炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡。事實上，許多麻醉藥物能夠影響促炎細胞因子的表達。研究證實，異氟醚等多種吸入麻醉藥抑制器官的缺血再灌注損傷也與其抗炎、抗凋亡作用相關(guān)，減少NF－κB的激活，減少TNF－α、IL－1、ICAM－1和iNOS的表達，增強抗凋亡蛋白Bcl－2等表達。異氟醚可以通過抑制ICAM－1的表達和減少中性粒細胞的遷移以減輕大鼠肝局部缺血再灌注的損傷［4］。另外，異氟醚還能通過下調(diào)小鼠血漿TNF－α和IL－6水平，減少了腹膜炎敗血癥所致的肝腎功能損害和死亡率［5］。本研究表明，大鼠靜脈注射脂多糖誘導(dǎo)急性炎癥，導(dǎo)致BALF中炎癥細胞增多以及BALF和血漿中 TNF－α、IL－2和INF－γ的表達增加，這暗示了炎癥促使炎癥細胞滲漏和激活并釋放出炎癥細胞因子從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。通過用異氟醚預(yù)處理可以明顯地抑制BALF中炎癥細胞（尤其是中性粒細胞和淋巴細胞）增加以及BALF和血漿中 TNF－α、IL－2和INF－γ的表達，該結(jié)論與相關(guān)研究一致。這充分地說明了異氟醚具有抗炎作用，能夠抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，在一定的程度上減緩了炎癥反應(yīng)。Adams等［6］研究也表明，大鼠腹腔注射吸入麻醉藥能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的IL－6／IL－10的比率并能減輕炎癥反應(yīng)。薛紀(jì)秀等［7］研究表明丙泊酚和異氟醚能減少胰島素（IN）、TNF－α、IL－6和胰島素抵抗指數(shù)及在一定程度上減輕了應(yīng)激反應(yīng)。因此。這對今后臨床上麻醉藥物的使用提供了理論指導(dǎo)和現(xiàn)實基礎(chǔ)。也有研究表明，利多卡因預(yù)處理可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的兔促炎因子IL－6、TNF－α的釋放和減輕內(nèi)毒素誘發(fā)的兔肺毛細血管通透性增加、肺部炎癥細胞浸潤及內(nèi)皮細胞損傷［8］。但也有實驗顯示，直接給予大鼠異氟醚上調(diào)了大鼠肺臟炎性因子的水平［9］。這可能與實驗條件及炎癥模型不同有關(guān)。盡管有點矛盾，但更多的研究證明，鹵族類吸入性麻醉劑預(yù)處理對肺缺血再灌注損傷和神經(jīng)具有保護作用［10－11］。

Flondor等［12］研究表明，大鼠靜脈注射內(nèi)毒素脂多糖后用吸入性麻醉藥異氟烷處理可以抑制促炎細胞因子TNF－α及IL－1β的釋放，產(chǎn)生抗炎作用。同時，體外研究也表明，麻醉藥丙泊酚和氯胺酮可抑制脂多糖刺激的PBMC細胞因子的表達［13］。Weber等［14］研究表明，異氟烷能有效抑制人的臍靜脈內(nèi)皮細胞所產(chǎn)生的TNF－α和血管細胞黏附分子－1的分泌。與本研究結(jié)果一致。

目前，不同的麻醉藥物對細胞因子產(chǎn)生的影響還存在一定的爭議，其機制不是十分清楚。本研究表明了吸入麻醉藥預(yù)處理通過抑制促炎細胞因子產(chǎn)生抗炎作用，可應(yīng)用于手術(shù)上的免疫和抗感染等方面。因此，根據(jù)患者病情、手術(shù)大小，尤其是那些免疫功能異常、感染、創(chuàng)傷的高危手術(shù)患者，選擇合適的麻醉藥物維持細胞因子平衡，以調(diào)節(jié)機體免疫，具有重要的臨床意義。

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