六味地黃湯通過缺氧誘導(dǎo)因子1α途徑對5／6腎切除大鼠腎間質(zhì)纖維化的抑制作用＊

唐 群，何澤云，陳 麗，徐文峰，曾海飛

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007）

研究指出，腎小管間質(zhì)部分的慢性氧缺失是促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展和纖維化的重要原因［1］。體外實(shí)驗(yàn)證明，缺氧可刺激腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化，參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展［2］，缺氧主要通過缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia－inducible factor 1α，HIF－1α）發(fā)揮作用［3］，后者可調(diào)控結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)。現(xiàn)將本研究探討HIF－1α在慢性腎間質(zhì)纖維化中的作用以及六味地黃湯對其表達(dá)的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房。

1.1.2 藥物 六味地黃湯（熟地黃24g，山藥12g，山茱萸12 g，澤瀉9g，茯苓9g，牡丹皮9g）購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。先將藥材用相當(dāng)于藥材5倍的自來水浸泡2 h，煮沸后再微火煎熬30min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮，取二煎液。將兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮藥液至含生藥1g／mL。

1.1.3 主要試劑 一抗為兔抗大鼠HIF－1α、CTGF多克隆抗體（美國Santa Cruz），兔二步法檢測試劑盒（PV－6001）、二抗為非生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）、模型組（10只）和六味地黃湯組（10只）。假手術(shù)組打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟，不切除腎臟。模型組、六味地黃湯組大鼠均在無菌條件下進(jìn)行5／6腎切除術(shù)，以10%水合氯醛0.30mL／100g腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪巾，從左腹部切口，打開腹腔，靜脈夾夾住腎蒂后迅速切除左腎上下極（切除2／3），以吸收性明膠海綿壓迫止血，復(fù)位腎臟。1周后進(jìn)行第2次手術(shù)，切除右側(cè)腎臟。右腎摘除術(shù)后第2天，六味地黃湯組予以六味地黃湯灌胃（生藥含量按公式：人的劑量×0.018×5／kg體質(zhì)量計(jì)算），每天1次，至處死為止；模型組、假手術(shù)組以等容積蒸餾水灌胃，給藥8周后全部處死，中途死亡的大鼠直接剔除。

1.2.2 標(biāo)本收集 各組大鼠分別于灌胃第8周后處死，處死前收集24h尿量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測24h尿清蛋白（24urinary albumin，24hUAlb）。腹主動(dòng)脈采血分離血清，酶法測定血肌酐（serum creatinine，Scr）濃度，尿素酶－GLDH 法測定血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度。腎組織分為兩部分處理：（1）光鏡觀察。標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，分別行HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)檢測。（2）腎組織取出后立即放入液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存待用。

1.2.3 腎臟組織學(xué)檢查 腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度為3～4μm）后，分別進(jìn)行HE染色及Masson染色，Olympus顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)采用兔二步法檢測試劑盒（PV－6001），一抗用兔抗大鼠抗體，一抗及工作濃度：HIF－1α（1∶100）、CTGF（1∶200），二抗用相應(yīng)羊抗兔抗體，染色呈棕褐色者為陽性染色。

1.2.5 圖像分析 Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)分析系統(tǒng)（Motic Med 6.0）進(jìn)行圖像分析。測定視野內(nèi)免疫陽性細(xì)胞的平均灰度值，以灰度值進(jìn)行定量分析，測得組織細(xì)胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1.2.6 Western blot檢測 常規(guī)提取蛋白質(zhì)樣品，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每泳道50μg蛋白，10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，加一抗，一抗及工作濃度：HIF－1α（1∶200）、CTGF（1∶300），4℃孵育過夜。洗膜，加相應(yīng)二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，ECL試劑在暗室中發(fā)光，X線膠片曝光、顯影、定影。掃描測定條帶密度值，以與β－actin的比值作為表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎臟功能的影響 見表1。

2.2 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響HE染色下，假手術(shù)組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯異常；模型組腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，硬化增多，腎小管明顯萎縮、消失，部分腎小管發(fā)生代償性擴(kuò)張，可見蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化明顯，大量淋巴細(xì)胞浸潤。六味地黃湯組病變程度較模型組明顯減輕（圖1）。Masson染色下，假手術(shù)組腎小球和腎小管僅基底膜染成藍(lán)色，腎間質(zhì)無明顯膠原纖維；模型組腎間質(zhì)見大量染成藍(lán)色的膠原纖維；六味地黃湯組腎間質(zhì)可見少量膠原纖維，膠原沉積較模型組明顯減輕（圖2）。

2.3 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織 HIF－1α、CTGF表達(dá)的影響

2.3.1 HIF－1α的表達(dá) 假手術(shù)組 HIF－1α微量表達(dá)，主要在腎皮髓質(zhì)交界處，模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中均表達(dá)增加，腎小球表達(dá)不明顯（圖3）。

表1 3組大鼠腎臟功能檢測結(jié)果（±s）

表1 3組大鼠腎臟功能檢測結(jié)果（±s）

＊：P＜0.05，與六味地黃湯組比較。

組別 n 24hUAlb（mg）BUN（mmol／L） Scr（μmol／L）假手術(shù)組 10 3.60±1.40＊ 6.49±0.98＊ 59.60±5.82＊模型組 7 22.12±1.05＊ 13.54±1.33＊ 87.42±6.92＊六味地黃湯組9 19.08±2.02 11.66±1.20 77.44±5.68

2.3.2 CTGF的表達(dá) 假手術(shù)組CTGF表達(dá)不明顯，模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中CTGF均表達(dá)明顯增加，腎小球表達(dá)不明顯（圖4）。

2.3.3 腎組織HIF－1α、CTGF表達(dá)半定量分析 3組腎組織HIF－1α、CTGF表達(dá)在模型組最強(qiáng)，六味地黃湯組次之，假手術(shù)組最弱。與六味地黃湯組比較，模型組HIF－1α、CTGF的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），見表2。

圖1 3組大鼠腎臟的病理改變（HE染色，×250）

圖2 3組大鼠腎臟的病理改變（Masson染色，×250）

圖3 3組大鼠腎組織HIF－1α的蛋白表達(dá)水平（IHC，×400）

圖4 3組大鼠腎組織CTGF的蛋白表達(dá)水平（IHC，×400）

圖5 3組大鼠腎組織HIF－1α蛋白表達(dá)電泳圖

表2 3組大鼠腎組織HIF－1α、CTGF表達(dá)的平均灰度值（±s）

表2 3組大鼠腎組織HIF－1α、CTGF表達(dá)的平均灰度值（±s）

＊：P＜0.05，與六味地黃湯組比較。

組別 n HIF－1αCTGF假手術(shù)組 10 215.30±24.60＊ 223.00±21.50＊模型組 7 141.00±12.20＊ 137.60±14.10＊六味地黃湯組9 170.70±10.90 184.20±11.40

2.4 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織 HIF－1α、CTGF蛋白水平的影響 與六味地黃湯組比較，模型組HIF－1α、CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖5～8。

圖6 Western blot檢測3組HIF－1α的表達(dá)

圖7 3組大鼠腎組織CTGF蛋白表達(dá)電泳圖

圖8 Western blot檢測3組CTGF的表達(dá)

3 討 論

HIF－1是1992年Semenza等在低氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一能在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明，缺氧激活的轉(zhuǎn)錄因子HIF－1α在纖維化發(fā)展中起至關(guān)重要的作用［4］。慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的最終結(jié)局，其主要病理學(xué)特征為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。慢性缺氧可誘發(fā)HIF－1α持續(xù)表達(dá)，后者上調(diào)一系列促纖維化靶基因?qū)е履I間質(zhì)纖維化。因此，慢性缺氧是引起腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)關(guān)鍵因素［5］，而 HIF－1α是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因子［6－7］。

5／6腎切除大鼠是目前研究慢性腎臟病進(jìn)展的理想動(dòng)物模型。已有研究表明，5／6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動(dòng)脈病變，這種小動(dòng)脈病變可導(dǎo)致腎小球后毛細(xì)血管血流減少和腎小管間質(zhì)缺血，而缺血就意味著低氧。Manotham等［8］研究證實(shí)，在5／6腎切除大鼠模型中，在發(fā)生腎小管纖維化前，腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等［9］研究證實(shí)，管周毛細(xì)血管丟失和腎小管間質(zhì)缺氧在腎間質(zhì)纖維化不明顯之前的早期階段（術(shù)后第3周）已經(jīng)很嚴(yán)重，并且持續(xù)存在于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中。Zeng等［10］研究發(fā)現(xiàn)，HIF－1α在5／6腎切除大鼠腎組織中顯著升高，這一結(jié)果證實(shí)慢性缺氧存在于5／6腎切除模型。俞小芳等［11］研究5／6腎切除大鼠亦發(fā)現(xiàn)在早期階段（術(shù)后第1周末），HIF－1α在腎內(nèi)表達(dá)即開始增加，在術(shù)后12周仍有持續(xù)表達(dá)。Kimura等［6］通過應(yīng)用5／6腎切除的基因敲除小鼠模型證實(shí)了HIF－1α具有促進(jìn)腎纖維化的作用，認(rèn)為抑制HIF－1α的表達(dá)是治療腎臟纖維化的靶點(diǎn)。此外，CTGF是目前公認(rèn)的較強(qiáng)的促纖維化生長因子，其表達(dá)受 HIF－1α調(diào)控［12］。本研究顯示模型組存在明顯的纖維化，且與假手術(shù)組比較，模型組腎組織中HIF－1α、CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說明HIF－1α可能通過調(diào)節(jié)CTGF的表達(dá)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。

六味地黃丸是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑［13］。其臨床療效肯定，但其作用機(jī)制缺乏深入研究。何澤云等［14］研究發(fā)現(xiàn)5／6腎切除大鼠在術(shù)后8周，留存腎不可避免地發(fā)生了間質(zhì)纖維化。給5／6腎切除大鼠灌胃六味地黃湯8周后，其BUN、Scr的水平明顯低于模型組，并能減少留存腎系膜細(xì)胞的增生及間質(zhì)纖維化，使腎切除大鼠生存期延長［15］。蔡惠芳等［16］研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸具有改善5／6腎切除大鼠殘腎腎功能的作用，其改善殘腎腎功能的作用與六味地黃丸提高腎小球的體積密切相關(guān)。李萬斌等［17］研究認(rèn)為，六味地黃丸可能通過促進(jìn)MMP－2的表達(dá)，對抗Ⅳ膠原的過度沉積，減輕硬化程度，達(dá)到保護(hù)腎臟、延緩腎衰竭進(jìn)程的積極作用。目前，從缺氧的角度探討六味地黃湯延緩腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究尚未見報(bào)道，缺氧是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要原因，而六味地黃湯具有耐缺氧、抗氧化的作用，為本研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，六味地黃湯組HIF－1α、CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示六味地黃湯延緩腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制可能是通過改善缺氧從而抑制HIF－1α的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)CTGF的蛋白水平，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。

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