耐甲硝唑幽門螺桿菌的差異蛋白質(zhì)組學(xué)

呂麗艷 夏美玲 姚淑娟 劉伯陽 溫達(dá)靜

胃癌的發(fā)病率和病死率有著明顯的地域性，主要分布在亞洲的一些國家，例如日本、中國和其他東亞國家，有較大的危害性[1]。而感染幽門螺桿菌（Hp）是胃潰瘍、十二指腸潰瘍及原發(fā)性胃癌的主要致病因素。根治Hp是預(yù)防潰瘍和胃癌的主要臨床策略。甲硝唑作為以往最有效的治療藥物在臨床出現(xiàn)較多耐藥病例，這給Hp的防治帶來較大麻煩[2]。發(fā)現(xiàn)耐藥菌株和正常感染菌株的差異，尋找更為有效的治療策略成為當(dāng)前研究者普遍研究的熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥標(biāo)記物的篩選中、藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及臨床疾病的早期診斷中。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如高壓液相色譜、二維電泳、表面增強(qiáng)激光電離質(zhì)譜等，在生物學(xué)領(lǐng)域越來越多地發(fā)揮著重要作用。本實驗應(yīng)用二維電泳串聯(lián)MALDI-TOF的方法，分析正常Hp菌與耐甲硝唑Hp菌的蛋白表達(dá)差異，從而為發(fā)現(xiàn)藥物靶點提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 Hp 26695菌株（上海第二醫(yī)科大學(xué)惠贈）。

1.2 實驗儀器與試劑 質(zhì)譜儀美國AB公司VOYAGER Biospeetromet；雙向凝膠電泳儀器：安瑪西亞有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三輕甲基胺基甲烷(TriS)、甘氨酸、漠酚藍(lán)、乙二胺四乙酸均購自德國Merck公司；碘乙酞胺(IAM)、低熔點瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司；甲酸、碳酸氫銨從美國Fisher公司購買；測序級胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑Roehe公司購買；線性IPG膠條購自GE Healtheare Amersham公司。其他化學(xué)試劑主要購于本地化學(xué)試劑公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗甲硝唑Hp誘導(dǎo) 將Hp 26695接種于瓊脂平板，置于37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)，接種于含不同濃度甲硝唑（1，2，4，8，16μg/mL）的液體培養(yǎng)基中，置于微需氧環(huán)境培養(yǎng)72h，觀察Hp是否被抑制，選出耐藥株。然后在不含甲硝唑的培養(yǎng)基中連續(xù)傳3次，檢測耐藥性形成的穩(wěn)定性。

1.3.2 樣品制備 正常和耐藥Hp分別培養(yǎng)于大約20個9cm×9cm平板，微需氧條件培養(yǎng)，收集細(xì)菌，7000g，離心30min，收集沉淀，提取總蛋白，通過2-DE技術(shù)分離，凝膠顯色，得到蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，利用Image Master軟件進(jìn)行圖像分析，尋找敏感株與耐藥株的差異性蛋白質(zhì)斑點。以2倍或2倍以上變化的為差異點，共29個點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.3 質(zhì)譜檢測 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行差異點鑒定。通過分析軟件分析得到的質(zhì)譜結(jié)果。

1.3.4 數(shù)據(jù)庫檢索 UCSF數(shù)據(jù)庫檢索蛋白功能。

2 結(jié)果

2.1 敏感hp株與耐甲硝唑Hp株二維電泳結(jié)果見圖1、2。

圖1 敏感Hp二維電泳圖

圖2 耐藥Hp二維電泳圖

2.2 通過軟件分析，差異點大于等于2倍的凝膠通過MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，我們共發(fā)現(xiàn)27個差異蛋白質(zhì)。耐藥菌株與敏感菌株相比，8個蛋白表達(dá)下降，19個表達(dá)上升。功能涵蓋：熱休克蛋白、細(xì)胞呼吸鏈相關(guān)酶類、細(xì)胞壁及鞭毛合成的部分結(jié)構(gòu)蛋白、金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白和DNA突變蛋白等功能性蛋白質(zhì)。主要蛋白的質(zhì)譜信息，見表1。部分質(zhì)譜檢測結(jié)果見圖3、4。

圖3 蛋白UvrABC system protein A質(zhì)譜鑒定圖

圖 4 蛋白Chaperone protein HtpG質(zhì)譜鑒定圖

表1 差異蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果

3 討論

目前世界范圍內(nèi)根治Hp感染的方案主要是抗生素聯(lián)合治療。2種或3種抗生素共同作用可以有效根除Hp，但是目前臨床的抗藥性情況越來越嚴(yán)重，使醫(yī)務(wù)工作者們不得不關(guān)注抗藥性產(chǎn)生的各種相關(guān)因素。其中耐甲硝唑Hp的臨床研究是主要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn)Hp對甲硝唑的耐藥機(jī)制與rdxA、frxA和fdxB基因突變相關(guān)，其中rdxA基因編碼對氧不敏感的NADPH硝基還原酶，frxA編碼NADPH flavin oxidoreductase，fdxB編碼ferredoxin-like protein蛋白。

本研究中發(fā)現(xiàn)，耐藥Hp菌株與敏感株比較，表達(dá)水平增高的蛋白主要的是Chaperone protein HtpG、（一種熱休克蛋白）、UvrABC system protein A、Transcription-repaircoupling factor（UvrB family，破壞DNA 結(jié)構(gòu)）、adenosine tRNA methylthiotransferase MiaB（離子轉(zhuǎn)運）、Flagellar hook-associated protein 2（鞭毛形成），Protein translocase subunit SecA（ATP結(jié)合和金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白）、NADP-specific glutamate dehydrogenase、Uracil-DNA glycosylase、MutS2 protein等，可以分析得出結(jié)論：耐甲硝唑Hp菌株應(yīng)變外界變化，熱休克蛋白增加；而抗生素的外界壓力誘使細(xì)菌DNA突變和錯配率升高；為了更好定植，鞭毛形成蛋白也起到錨定的作用，對抗外界環(huán)境變化；同時為了更好地適應(yīng)外界抗生素環(huán)境，細(xì)菌需要更強(qiáng)的呼吸作用，所以一些和呼吸相關(guān)的酶類數(shù)量上升較為明顯。

本研究中同時發(fā)現(xiàn)，耐藥菌株與敏感株比較表達(dá)水平降低的蛋白質(zhì)主要是Uncharacterized aminotransferase HP_0736、Elongation factor G、Protein translocase subunit SecA ATP、Translation initiation factor IF-2、Histidine-tRNA ligase、Molybdopterin synthase catalytic subunit等，主要的都是擔(dān)任細(xì)菌分解作用的和代謝有關(guān)的酶類，可以推論細(xì)菌在適應(yīng)外界抗生素環(huán)境時，分解和代謝能力下降，以適應(yīng)外界不良環(huán)境。這些結(jié)果與一些文獻(xiàn)[3-4]的研究有部分被提及，但本文發(fā)現(xiàn)的引起DNA錯配和突變蛋白質(zhì)如：MutS2 protein，及部分代謝類蛋白質(zhì)尚無報道。有待進(jìn)一步研究探索。

總之，研究本文相關(guān)功能蛋白質(zhì)變化情況可以得出結(jié)論，敏感菌株和耐甲硝唑Hp中相關(guān)基因已經(jīng)發(fā)生突變，其中呼吸鏈相關(guān)蛋白和金屬轉(zhuǎn)運蛋白，熱休克蛋白可以進(jìn)一步進(jìn)行功能研究，從而篩選耐甲硝唑菌株差異的相關(guān)蛋白作為藥物靶點[5]：例如DNA突變和錯配的蛋白質(zhì)MutS2 protein可以考慮作為抗藥靶點，從而為科研及臨床Hp治療提供有力的理論依據(jù)和研究方向。

[1]郭剛，鄒全明.幽門螺桿菌的基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2003，11(12)：2022-2026.

[2]Rizzato C,Kato I,Plummer M,et al.Risk of advanced gastric precancerous lesions in Helicobacter pylori infected subjects is influenced by ABO blood group and cagA status[J].Int J Cancer.2013 Jul 15;133(2):315-322.

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