黃酮類化合物與α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的脈沖輻解研究

張福根 周瀚洋 彭 靜 吳季蘭

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，北京100871)

1 引言

生物體新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基可以與不飽和脂肪酸反應(yīng)生成脂質(zhì)過氧自由基，而脂質(zhì)過氧化反應(yīng)(LPO)是導(dǎo)致許多病理現(xiàn)象的主要原因.1研究發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于植物界、含有γ-吡喃酮母體結(jié)構(gòu)的低分子量黃酮類化合物是有效的自由基清除劑和LPO抑制劑.2-5目前對于黃酮類化合物與過氧自由基反應(yīng)的機理主要有以下兩種觀點:一種比較流行的觀點是單電子氧化機理，6-9即過氧自由基與黃酮類化合物發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并奪取酚羥基的氫，生成的酚氧自由基再失去電子，生成醌類化合物(如圖1所示)，同時過氧自由基由于得到了電子或氫原子而被還原.在這個過程中，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中B環(huán)鄰二羥基是必要的結(jié)構(gòu)，而其它要素如A環(huán)羥基和C環(huán)雙鍵不起作用或只起促進電子離域的作用，不直接參與反應(yīng).但這一機理不能解釋B環(huán)無羥基的黃酮類化合物如黃岑甙也能有效地清除過氧自由基.10-13此外，也缺少符合物料平衡的終產(chǎn)物分析.

另一種觀點14-18認為過氧自由基可與共軛雙鍵或黃酮類化合物的C環(huán)雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，加成產(chǎn)物再通過分解或重排等后續(xù)反應(yīng)生成最終產(chǎn)物(如圖2所示).

圖1 黃酮類化合物與過氧自由基反應(yīng)的單電子氧化機理Fig.1 One-electron oxidation between flavonoids and peroxyl radicals

圖2 黃酮類化合物與過氧自由基的雙鍵加成反應(yīng)Fig.2 Possible conjugate addition reaction between flavonoids and peroxyl radicals

究竟以上兩種機理哪個更主要，目前還不清楚.因此研究不同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng)速率有助于闡明該反應(yīng)的化學(xué)機理.由于許多黃酮類化合物在中性水溶液中的溶解度很低，若滴加堿使之溶解，則體系的pH遠遠偏離生理條件下的pH，因此我們選擇乙醇作為溶劑來研究黃酮類化合物與有機過氧化自由基的反應(yīng).在空氣或氧氣飽和的乙醇中，經(jīng)過電離輻射后會生成α-羥乙基過氧自由基，可作為有機過氧自由基的模擬物來研究黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng).對于α-羥乙基過氧自由基的自身衰減以及它與黃酮類化合物的反應(yīng)已有報道，19-24但反應(yīng)多在乙醇的水溶液中進行，仍難以解決溶解度的問題，同時對于α-羥乙基過氧自由基在純乙醇中的衰減只近似作為二級反應(yīng)動力學(xué)處理，忽視了其實際蛻變過程為一級和二級反應(yīng)混合類型.

用脈沖輻解的方法可以選擇性地產(chǎn)生單一的自由基粒種，并檢測其在很短時間內(nèi)的變化，從而使自由基反應(yīng)的動力學(xué)研究成為可能.25-27我們28已經(jīng)報道過在乙醇溶液中用脈沖輻解的方法研究α-羥乙基過氧自由基的自身衰減動力學(xué)，并得到了其衰減的一級和二級動力學(xué)常數(shù).本文繼續(xù)在乙醇溶液中用脈沖輻解的方法詳細研究了α-羥乙基過氧自由基與幾種典型的黃酮類化合物以及模型化合物的反應(yīng)動力學(xué).

2 實驗部分

圖3 實驗中所用黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of flavonoids used in this work

實驗中所用的幾種黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)列于圖3.所用試劑為槲皮素(quercetin，生化試劑，純度≥95%，Sigma公司產(chǎn)品)，蘆丁(rutin，生化試劑，上海試劑二廠，使用前用三次蒸餾水重結(jié)晶)，黃岑甙(baicalin，化學(xué)對照品，中國藥品生物制品檢定所，使用前用乙醇重結(jié)晶)，兒茶素(catechin，純度≥99.0%，Sigma公司產(chǎn)品)，黃酮體(flavone，ACROS公司產(chǎn)品)，鄰苯二酚(pyrocatechol，分析純，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站)和乙醇(優(yōu)級純，北京化工廠).

脈沖輻解采用微秒級脈沖輻解裝置(北京師范大學(xué)低能物理研究所).29每次輻照前用N2O飽和的硫氰化鉀溶液測定脈沖劑量，取Gε480nm[(SCN)2-]=4.41×102eV-1·mol-1·dm3·cm-1(其中，G 為輻射化學(xué)G值，即物質(zhì)每吸收100 eV所變化的分子數(shù).ε480nm表示在480 nm處的摩爾吸光系數(shù)).用Igor一級和二級混合反應(yīng)處理程序30對得到的脈沖輻解數(shù)據(jù)進行動力學(xué)處理.

3 結(jié)果與討論

3.1 α-羥乙基過氧自由基與幾種典型的黃酮類化合物的反應(yīng)

在受到電離輻射時，空氣或氧氣飽和的乙醇溶液中會產(chǎn)生α-羥乙基過氧自由基.30在脈沖輻解條件下，由于劑量率很大，α-羥乙基過氧自由基濃度較高，它主要通過單分子和雙分子兩種方式衰減，一級與二級衰減的速率常數(shù)分別為k1和k2.28

在260-300 nm范圍內(nèi)，α-羥乙基過氧自由基的最大吸收在270 nm處(圖4內(nèi)插圖)，但黃酮類化合物一般在285 nm處吸收最低，為了最大限度地降低黃酮類化合物對過氧自由基吸收的干擾，我們選擇了285 nm作為檢測波長，研究黃酮類化合物的乙醇溶液中有機過氧自由基的動力學(xué)行為.

不同濃度的槲皮素乙醇溶液中α-羥乙基過氧自由基的衰減擬合曲線如圖4所示.由圖4可見，隨著槲皮素濃度增加，過氧自由基的衰減速度明顯加快.

在黃酮類化合物的乙醇溶液中，經(jīng)過電離輻照產(chǎn)生的α-羥乙基過氧自由基除了通過一級和二級兩種方式衰減之外，還會與黃酮類化合物發(fā)生反應(yīng):

圖4 槲皮素濃度對α-羥乙基過氧自由基在乙醇中衰減曲線的影響Fig.4 Effect of concentrations of quercetin on the decay of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals in ethanol

當(dāng)槲皮素的濃度遠遠大于有機過氧自由基的濃度時，式(4)可簡化為:

式中表觀一級反應(yīng)速率常數(shù)

用Igor脈沖輻解數(shù)據(jù)處理程序?qū)y得的數(shù)據(jù)進行處理，得到槲皮素不同濃度下的表觀一級反應(yīng)速率常數(shù)k*

1，對槲皮素濃度作圖，得到一條直線(圖5a)，直線的斜率即為槲皮素與有機過氧自由基反應(yīng)速率常數(shù)k3，直線的截距則為有機過氧自由基單分子衰減的速率常數(shù)k1.本文中其它幾種黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng)也采用同樣的方法處理，結(jié)果如圖5所示.

從圖5中得到4種黃酮類化合物與α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的速率常數(shù)k3，列于表1中.

由表1可知，(1)槲皮素和蘆丁與有機過氧自由基的反應(yīng)非?？?，同時，比較二者結(jié)構(gòu)可知，C環(huán)C3-醣甙的存在與否對反應(yīng)影響不大;(2)當(dāng)A環(huán)含有C5羥基與C環(huán)C2＝C3以及B環(huán)鄰二羥基共存時可以明顯提高反應(yīng)速率;(3)不含有B環(huán)鄰二羥基的黃岑甙與有機過氧自由基的反應(yīng)速率常數(shù)接近于蘆丁以及槲皮素的反應(yīng)速率常數(shù)，而含有B環(huán)鄰二羥基結(jié)構(gòu)的兒茶素與有機過氧自由基的反應(yīng)速率常數(shù)則要小近1個數(shù)量級.這表明在黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng)中，C環(huán)C2＝C3雙鍵或B-C環(huán)大π共軛鍵的抗脂質(zhì)過氧化性好于B環(huán)的鄰二羥基.

圖5 α-羥乙基過氧自由基的表觀反應(yīng)速率常數(shù)與黃酮類化合物濃度關(guān)系Fig.5 Relationship between apparent decay rate of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals and concentration of flavonoids

3.2 α-羥乙基過氧自由基與模型化合物的反應(yīng)

為了進一步闡明黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)官能團在與有機過氧自由基的反應(yīng)中所起的作用，我們又選擇了兩種黃酮類化合物的模擬物:黃酮體以及鄰苯二酚，測定了它們與α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的速率常數(shù)，結(jié)果如圖6所示.

從圖6得到黃酮體和鄰苯二酚與α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的速率常數(shù)分別為(1.7±0.1)×106和(2.9±0.1)×105mol-1·dm3·s-1，見表1.作為2，3-雙鍵模型化合物的黃酮體比作為鄰二羥基模型化合物的鄰苯二酚與有機過氧自由基的反應(yīng)要快1個數(shù)量級.這進一步證明了在黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng)中，C環(huán)C2＝C3或B-C環(huán)的大π共軛鍵的作用大于B環(huán)的鄰二羥基.因此可以推斷反應(yīng)過程中，主要是C環(huán)C2＝C3或B-C環(huán)的大π共軛鍵與過氧自由基發(fā)生雙鍵加成反應(yīng)，而A環(huán)C5位羥基在共軛體系中會給環(huán)提供電子，對其活性有一定的促進作用.該結(jié)果與我們前期對蘆丁與α-羥乙基過氧自由基的反應(yīng)產(chǎn)物的研究結(jié)果18相符合，我們通過分離分析得到蘆丁與α-羥乙基過氧自由基的產(chǎn)物主要是來自于C、B環(huán)斷開形成的2種產(chǎn)物，我們曾經(jīng)推測是由于C環(huán)C2＝C3或B-C環(huán)的大π共軛鍵比較活潑，與過氧自由基反應(yīng)重排后形成.

表1 黃酮類化合物與有機過氧自由基的反應(yīng)速率常數(shù)Table 1 Rate constants of the reactions between flavonoids and α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals

圖6 α-羥乙基過氧自由基的表觀反應(yīng)速率常數(shù)與模型化合物濃度關(guān)系Fig.6 Relationship between apparent decay rate of α-hydroxyl ethyl peroxyl radicals and concentrations of model compounds

因此，由表1可知，清除α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的活性順序為:蘆丁＞槲皮素＞黃岑甙＞兒茶素＞黃酮體＞鄰苯二酚.該順序與其體外清除脂質(zhì)過氧自由基的效果31，32基本一致.文獻32報道，在乳化劑存在下，pH=7.8，37°C條件下得到的清除脂質(zhì)過氧自由基的活性順序為:蘆丁＞槲皮素＞兒茶素＞鄰苯二酚.Lu等33利用老鼠心臟做體外實驗，詳細研究了黃酮類化合物的抗脂質(zhì)氧化作用，發(fā)現(xiàn)在葡萄糖-葡萄糖氧化酶誘發(fā)的脂質(zhì)氧化反應(yīng)中，抗氧化劑的有效性是:槲皮素最好，蘆丁、黃岑甙和兒茶素差不多.可見，實際生物體系比較復(fù)雜，但抑制LPO的大致規(guī)律與抗氧化劑的抗氧化活性基本一致.最近，Xiao等34研究了多種黃酮類化合物結(jié)構(gòu)對其與α-淀粉酶親和性的影響，發(fā)現(xiàn)C環(huán)C2＝C3結(jié)構(gòu)有利于提高化合物與α-淀粉酶的親和性，主要是由于該結(jié)構(gòu)連接B環(huán)和C環(huán)而形成對位共軛效應(yīng)，有利于兩環(huán)形成近平面結(jié)構(gòu)，而該結(jié)構(gòu)容易進入蛋白質(zhì)中疏水性的囊腔內(nèi).所以，在脂質(zhì)抗氧化過程中，黃岑甙的抗氧化活性好于兒茶素可能也與其親和性好有關(guān).

4 結(jié)論

通過脈沖輻解法測定了4種典型黃酮類化合物(槲皮素、蘆丁、兒茶素以及黃岑甙)和2種模型化合物與α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的速率常數(shù)，發(fā)現(xiàn)它們清除α-羥乙基過氧自由基反應(yīng)的活性順序為:蘆丁＞槲皮素＞黃岑甙＞兒茶素＞黃酮體＞鄰苯二酚.研究表明，含有A環(huán)C5、C7羥基，C環(huán)C2＝C3或B-C環(huán)的大π共軛鍵以及B環(huán)鄰二羥基的黃酮類化合物可以快速地清除α-羥乙基過氧自由基.其中，A環(huán)C5羥基，B環(huán)鄰二羥基，C環(huán)C2＝C3或B-C環(huán)的大π共軛鍵結(jié)構(gòu)共存的黃酮類化合物反應(yīng)速率最快，而且C環(huán)C2＝C3雙鍵或B-C環(huán)的大π共軛鍵結(jié)構(gòu)的作用大于B環(huán)鄰二羥基結(jié)構(gòu)，而C環(huán)是否含有C3-醣甙結(jié)構(gòu)沒有明顯影響.因此我們認為在抑制LPO過程中，黃酮類化合物中的C環(huán)C2＝C3結(jié)構(gòu)起主要作用.

致謝: 本工作得到了北京師范大學(xué)的劉安東教授和李鳳梅教授的幫助，在此表示感謝.

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