自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)及意義*

艾 國 肖 芳 汪 鵬 嚴(yán)偉明 黃加權(quán) 寧 琴

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）的病因和發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未得到完全闡明，遺傳易感、病毒感染、自身免疫異常等多種因素均可能參與其發(fā)病[1]。程序性死亡因子（programmed death-l，PD-1）是CD28家族中新發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)抑制信號的共刺激分子，主要功能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化及分化[2]。PD-1及其配體（programmed death–ligand 1，PD-L1）相互作用可對初次免疫應(yīng)答和記憶性或效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞功能進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，從而抑制免疫反應(yīng)[3]?，F(xiàn)有的研究表明，PD-1信號通路參與病毒性及微生物感染性疾病的進(jìn)程[4，5]，在移植免疫[6]和腫瘤的免疫逃逸[7]中發(fā)揮著重要的作用。此外，PD-1的表達(dá)也與多種自身免疫性疾病如自身免疫性腦脊髓炎、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8～10]。然而，PD-1在AIH發(fā)病中的作用卻鮮有報(bào)道。本研究擬通過檢測AIH患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)情況，從疾病分期和性別的角度加以對比分析，以探討其在AIH發(fā)生發(fā)展中的意義，為AIH的免疫損傷及發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象 選取2012年9月至 2013年3月在我院就診的AIH患者22例，男6例，女16例，平均年齡41.4±1.5歲。其中7例在服用潑尼松龍治療后達(dá)到緩解，其余15例處于發(fā)病期未行免疫抑制劑治療。同時(shí)選取健康獻(xiàn)血者20例作為對照組，男8例，女12例，平均年齡29.0±0.5歲。病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2008年國際免疫性肝炎小組（IAIHG）提出的AIH簡化診斷積分系統(tǒng)及2010年美國肝病學(xué)會（AASLD）更新的有關(guān) AIH的診斷和治療指南[11，12]。排除肝炎病毒感染及藥物性、酒精性和遺傳代謝性肝病等。

二、主要試劑 FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD3單克隆抗體、APC標(biāo)記的小鼠抗人CD8單克隆抗體、PE標(biāo)記的小鼠抗人PD-1單克隆抗體、小鼠IgG同型抗體和紅細(xì)胞裂解液均購自美國BD公司。

三、外周血淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)的檢測 采集外周靜脈血2ml，肝素抗凝，取100μL全血，分別加入小 鼠 抗 人 PD-l-PE、CD3-FITC和 CD8-APC各10μL，4℃避光孵育30min；加入2ml紅細(xì)胞裂解液避光靜置10min，加緩沖液洗滌3次后，取2%多聚甲醛300μL重懸細(xì)胞，立刻上機(jī)（BD FACS CantoTMⅡ型流式細(xì)胞儀）檢測，用Cell Quest軟件獲取標(biāo)本中的細(xì)胞，以FSC和SSC設(shè)門讀取細(xì)胞，以CD3及CD8雙陽性圈定為CD8+T淋巴細(xì)胞，再測定外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1陽性比例。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以GraphPad Prism 5.0作統(tǒng)計(jì)繪圖，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組計(jì)量資料比較用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、AIH患者及健康對照外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1總體表達(dá)情況 22例AIH患者的CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)率為2.56±0.45%，明顯高于20例健康對照的0.46±0.06%，具有顯著性差異（P<0.001，圖1）。

圖1 兩組人群外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)的比較

二、不同疾病活動分期的AIH患者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)的變化 在AIH發(fā)病期（15例），外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)頻率為2.6±0.7%，略低于緩解期（7例）的3.4±0.8%，但無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.5737）。

三、不同性別的AIH患者及健康對照外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)頻率的比較 12例女性健康對照人群外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)率為0.32±0.1%，略高于8例男性人群的0.23±0.1%，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.6610）；16例女性AIH患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)率為3.5±0.7%，亦略高于6例男性患者的1.3±0.3%，但亦無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.1021）。

討論

PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的負(fù)性協(xié)同刺激分子，為免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，屬于CD28超家族成員。PD-1與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）具有 23%的氨基酸同源性[2]，但其表達(dá)卻與CTLA-4不同，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞上[13]，說明PD-1比CTLA-4具有更廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。PD-1與其配體 PD-L1（B7-HI）或 PD-L2（B7-DC）結(jié)合后，通過其胞漿尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM基序）傳入抑制信號，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[3]。諸多實(shí)驗(yàn)觀察了PD-1與其配體結(jié)合后對T細(xì)胞發(fā)生的作用，認(rèn)為PD-1整體上發(fā)揮免疫抑制作用，可抑制免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，對T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌及殺傷能力都有抑制作用，阻斷該通路后可以恢復(fù)T細(xì)胞的大部分功能[14，15]。在慢性HBV、HCV和HIV感染患者外周血T細(xì)胞尤其是病毒特異性CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)均上調(diào)，使其免疫功能受到抑制，病毒不能被有效清除而造成持續(xù)感染狀態(tài) 。

PD-1/PD-L通路抑制了免疫應(yīng)答的初始與效應(yīng)階段，維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)，否則過強(qiáng)的免疫應(yīng)答將導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[8]。而PD-1缺陷小鼠則可以發(fā)生自身免疫性疾病[9，10]。另外，在許多自身免疫病動物模型如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、自身免疫性糖尿病等動物，阻斷PD-1/PD-L通路則加速疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展。對自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者PD-1基因座的單核苷酸多態(tài)性的檢測也證實(shí)了這一點(diǎn)[18]。

本研究觀察了PD-l在AIH患者CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)，結(jié)果顯示在AIH患者CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)明顯高于正常對照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測PD-l的高表達(dá)可能是應(yīng)對自身免疫反應(yīng)的代償，但增高的PD-1對于免疫反應(yīng)的下調(diào)作用尚不足以控制疾病的發(fā)生和進(jìn)展。而疾病緩解期PD-1表達(dá)略高于發(fā)病期，雖然差異無顯著性，說明服用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素等可能通過增加PD-1的表達(dá)而發(fā)揮免疫抑制作用。PD-1/PD-L通路具有預(yù)防機(jī)體發(fā)生自身免疫或免疫亢進(jìn)的作用，但PD-1/PD-L通路活化后結(jié)果與前端刺激信號的強(qiáng)弱、持續(xù)時(shí)間有關(guān)，抗原濃度與PD-1表達(dá)程度的相對關(guān)系可能與AIH等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。AIH患者淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)增高也可能是PD-1/PD-L通路在共刺激通路中的功能障礙或正性刺激過強(qiáng)超過了負(fù)性抑制作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受失衡，以致其對免疫反應(yīng)的抑制性調(diào)控作用不能顯現(xiàn)，繼而發(fā)生病變。對不同性別的健康對照和AIH患者CD8+T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)分析可以發(fā)現(xiàn)，PD-1在女性表達(dá)略高于男性，差異無顯著意義，但為何女性更容易發(fā)生自身免疫肝炎則有待進(jìn)一步研究。我們認(rèn)為，PD-1在AIH患者體內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)的研究具有重要意義，外周血PD-1的檢測可以作為明確患者存在自身免疫功能紊亂的參考指標(biāo)。

本研究僅僅觀察了PD-1在AIH患者CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，而PD-1在其它細(xì)胞亞群以及B淋巴細(xì)胞上如何表達(dá)和PD-L在抗原遞呈細(xì)胞的表達(dá)及其免疫調(diào)控作用仍需要進(jìn)一步研究。包括PD-1在內(nèi)的負(fù)性與正性協(xié)同刺激信號構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對AIH的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需要更深層次的研究，能否通過上調(diào)負(fù)性協(xié)同刺激信號、阻斷正性刺激信號而逆轉(zhuǎn)AIH的進(jìn)展，仍需進(jìn)一步探索。隨著分子靶向治療時(shí)代的到來，認(rèn)識并把握AIH的免疫發(fā)病機(jī)制有助于推動治療AIH的抑炎與免疫調(diào)節(jié)新策略。

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