格爾德霉素體外抑制人肝癌細胞株HepG2增殖并促進凋亡

劉明強 莊少鵡 劉麗莎

原發(fā)性肝癌是指由肝細胞或肝內膽管細胞發(fā)生的腫瘤。作為人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國均較高，嚴重威脅著人民的健康和生命。我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，全世界每年新發(fā)肝癌約為25萬例，其中45%發(fā)生在中國，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，僅次于胃癌和食道癌。據(jù)統(tǒng)計，我國每年約有10萬人死于肝癌。目前，對于原發(fā)性肝癌，傳統(tǒng)的手術、介入和全身化療等療效欠佳，后者且具有很大的毒副作用。近年來，隨著對腫瘤分子水平認識的不斷深入，阻斷腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路逐漸成為抗腫瘤藥物研究的熱點領域。本課題試圖通過抑制HepG2細胞熱休克蛋白90（Heat Shock Protein 90，HSP90）的分子伴侶功能，從而實現(xiàn)對肝癌細胞內信號傳導通路的多點阻斷，以阻斷腫瘤賴以生存的信號通路網(wǎng)絡的功能發(fā)揮。

材料與方法

一、細胞與試劑 肝癌細胞株HepG2細胞（中國科學院上海細胞庫）；格爾德霉素（Geldanamycin，GA，美國Alexis公司）；胎牛血清（中國杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）和 MTT（美國Sigma公司）；PBS（中國福州邁新試劑公司）；PI（美國Beckman公司）；Annexin V-FITC凋亡試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

二、細胞培養(yǎng) 取HepG2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶內，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天傳代1次，選擇處于對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

三、細胞增殖抑制實驗 采用MTT法，選擇處于對數(shù)生長期的細胞，以每孔5.0×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl。培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，更換含不同濃度（0.2、0.4和0.8μmol/L）GA的培養(yǎng)液200μl，分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h、48h和72h。更換無血清培養(yǎng)液，同時每孔加入MTT溶液（5mg/m1）20μl，37℃、5%CO2條件下孵育 4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10～15min，使結晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度OD值。另設對照組（加培養(yǎng)液及細胞，不含藥物）及空白組（只加培養(yǎng)液，不含細胞和藥物），每個濃度設6個復孔。細胞增殖抑制率（%）=（對照組OD值－實驗組OD值）／（對照組OD值－空白組OD值）×100%

四、細胞凋亡率檢測 采用Annexin V法。取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種細胞于6孔培養(yǎng)板，24h后細胞貼壁，用無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，使之同步化后棄培養(yǎng)液，更換含不同濃度（0、0.2、0.4和 0.8μmol/L）GA的培養(yǎng)液 200μl繼續(xù)培養(yǎng)48h。與對照組細胞（只加培養(yǎng)液）同時收集，按晶美公司的Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明進行檢測，計算細胞凋亡率。

五、統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布的計量資料采用方差分析進行統(tǒng)計處理，多組間指標的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）、LSD-t或 SNK-q檢驗。對多個樣本間非正態(tài)分布的資料（凋亡率）比較采用Kruskal-Wllis H檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、GA對HepG2細胞生長的抑制作用 經(jīng)不同濃度的GA干預后，HepG2細胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制現(xiàn)象，且隨藥物干預濃度和干預時間的增加，GA對HepG2細胞增殖抑制率逐漸增高，呈劑量－時間雙效應關系（圖1）。

圖1 不同濃度GA對HepG2細胞增殖的影響

二、細胞凋亡的變化 在不同濃度的GA干預48h后，HepG2細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而漸增，且各組間細胞凋亡率有顯著性差異（P＜0.05，表1和圖2、圖3）。

表1 不同濃度GA作用48h后HepG2細胞凋亡率（%，±s）的變化

表1 不同濃度GA作用48h后HepG2細胞凋亡率（%，±s）的變化

與對照組比，①P＜0.05

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圖2 對照組HepG2細胞凋亡

圖30.8μM GA誘導HepG2細胞凋亡

討論

HSP90是一類廣泛存在于原核與真核細胞胞質中的高度保守的同型二聚體分子伴侶，可參與多種蛋白質的折疊和構象形成，在蛋白質的穩(wěn)定和成熟過程中起重要作用。HSP90是一種ATP依賴的伴侶蛋白，并且具有ATP酶的活性。當ATP與HSP90的N-末端ATP結構域結合后，HSP90構象發(fā)生改變，兩個N末端發(fā)生短暫結合形成一個“關閉”（close）狀環(huán)形結構，同時與HSP90結合的輔分子伴侶發(fā)生相應的轉換，此時，HSP90的受體蛋白處于穩(wěn)定的狀態(tài)，并能夠與配體結合或是能對刺激作出應答。當ATP水解成ADP后，HSP90的構象再次發(fā)生改變，與其結合的輔分子伴侶再次發(fā)生相應的轉換，復合物中的受體蛋白被釋放出來，隨后經(jīng)過泛素化-蛋白酶體途徑降解[1～4]。

目前被發(fā)現(xiàn)的HSP90的受體蛋白已經(jīng)超過100種，其中大部分蛋白質與細胞信號通路的轉導有關[5]。這些HSP90的受體蛋白主要包括：跨膜酪氨酸激酶（HER-2／neu、EGFR、MET、IGF1R）、亞穩(wěn)信號蛋白（Akt、Raf-1和 IKK）、成熟信號蛋白（p53、kit、Flt3、v-Src）、嵌合信號蛋白（NPM-ALK、Bcr-Abl）、甾體激素受體和細胞周期調節(jié)因子（cdk4和cdk6）等[6～9]。其中有一部分受體蛋白（如 Akt、Raf-1、HER-2/neu、CDK 4、CDK 6、Apaf-1、Nrf2等）與細胞周期的調節(jié)、細胞的轉化、細胞存活和與凋亡的信號轉導通路等有關[10，11]。因此，HSP90作為廣泛存在于細胞內的一類高度保守的分子伴侶，可通過維持其受體蛋白的穩(wěn)定與活性而間接參與細胞內多條重要的信號通路的轉導，從而多途徑多環(huán)節(jié)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進程，其獨特的性質使其成為抗腫瘤治療的良好分子靶點。

GA屬于苯醌安莎霉素類抗生素，起初GA的抗腫瘤效果被認為是特異性抑制酪氨酸激酶，但研究揭示其抗腫瘤能力是依賴于致瘤性蛋白激酶在蛋白酶體中的降解。目前，通過免疫沉淀技術和X線結晶研究揭示證實，GA在體內可與ATP競爭結合HSP90 N端的結合位點，從而改變HSP90構象，使其不能與受體蛋白及輔分子伴侶形成復合體，抑制其行使正常的分子伴侶功能，最終導致受體蛋白降解。本研究利用GA抑制HepG2細胞內HSP90分子伴侶功能可能阻斷腫瘤細胞賴以生存的信號通路網(wǎng)絡，破壞腫瘤細胞的生長優(yōu)勢，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究顯示，HSP90功能抑制劑GA可抑制肝癌HepG2細胞的生長增殖，抑制作用呈時效量效依賴關系。GA作用后HepG2細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，而且隨著藥物濃度的增高，GA對HepG2細胞的凋亡誘導作用增強，證實了HSP90在肝癌HepG2細胞增殖及存活中起重要作用。

我們發(fā)現(xiàn)GA能劑量依賴性地抑制肝癌HepG2細胞的增殖和誘導其凋亡，其機制可能主要為GA通過抑制HSP90的分子伴侶功能，導致其受體蛋白的降解，實現(xiàn)了腫瘤細胞內相關信號通路的阻斷，從而最后影響到腫瘤細胞生長。當然，細胞增殖及凋亡的調控是細胞因子間相互作用和相互影響而形成的復雜網(wǎng)絡，GA抑制人肝癌細胞增殖及促進其凋亡的作用，還可能通過多種細胞因子多種途徑來實現(xiàn)。相信在不久的將來，隨著研究的不斷深入和實驗技術的不斷推陳出新，GA多種抑瘤作用的分子機制將逐漸被闡明，這將為GA臨床應用治療肝癌及多種惡性腫瘤提供新的理論依據(jù)。

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