固體膠原蛋白加熱變性過(guò)程中的太赫茲介電譜研究

李向軍， 付秀華， 劉建軍， 杜 勇， 洪 治

1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院太赫茲技術(shù)與應(yīng)用研究所，杭州 310018；

2.中國(guó)計(jì)量學(xué)院信息工程學(xué)院，杭州 310018

引 言

膠原蛋白是一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維性蛋白質(zhì)，由三個(gè)多肽超螺旋結(jié)構(gòu)組成，平均分子量為0.36 MD，是重要的細(xì)胞外間質(zhì)成分，廣泛存在于人體的皮膚、骨骼、肌肉、軟骨、關(guān)節(jié)等組織中，起支撐、修復(fù)、保護(hù)三重作用，生理功能極其重要。因此，膠原蛋白成為臨床應(yīng)用較為廣泛的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物。然而，同大多數(shù)蛋白類(lèi)藥物一樣，膠原蛋白在生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中，多以固體形式存在，易受環(huán)境溫度的影響而發(fā)生變性。這是由于膠原蛋白的穩(wěn)定性有賴(lài)于分子間和分子內(nèi)各種作用的協(xié)同效應(yīng)，加熱可使分子間作用力減弱，破壞三股螺旋的穩(wěn)定性，從而使其喪失生物功能[1]。

目前，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的有示差掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)[2]、核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR)[3]、X射線衍射[4]、微波介電譜[5]和各類(lèi)光譜法。介電譜和光譜法具有快速、無(wú)損的特點(diǎn)，因而更具應(yīng)用潛力。目前已應(yīng)用到蛋白質(zhì)藥物檢測(cè)的光譜法包括紫外吸收譜、可見(jiàn)光吸收譜、圓二色譜 (circular dichroism，CD)、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)和拉曼光譜等。其中，大部分技術(shù)都不能提供分子的整體構(gòu)象和分子間相互作用的信息，而這些卻是對(duì)蛋白質(zhì)功能起決定性作用的[6]。

人們發(fā)現(xiàn)，反映DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子構(gòu)象的分子集體振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)位于THz波段，雖然我們可以用FTIR、自由電子激光、可調(diào)諧p-Ge激光和 (terahertz time domain spectroscopy，THz-TDS)等多種技術(shù)得到物質(zhì)的寬帶THz譜，但THz-TDS技術(shù)的出現(xiàn)才真正改變了THz譜研究的面貌。THz-TDS系統(tǒng)可以在常溫下工作，系統(tǒng)體積小，并可方便地用激勵(lì)源激發(fā)樣品，且光路靈活，可隨時(shí)監(jiān)測(cè)；尤其是可以同時(shí)測(cè)量太赫茲波電場(chǎng)的幅度和相位，可以直接得到樣品的吸收系數(shù)和折射率，或復(fù)介電常數(shù)，比單一的吸收譜可提供更多的樣品信息。這有利于對(duì)分子的振動(dòng)/轉(zhuǎn)動(dòng)模式進(jìn)行極化響應(yīng)建模，利用各種動(dòng)力學(xué)理論在THz波段研究蛋白質(zhì)熱變性問(wèn)題[5]。THz-TDS除了可以對(duì)物質(zhì)的復(fù)介電響應(yīng)表征外，還可以進(jìn)行具有時(shí)間分辨率的測(cè)量，即對(duì)分子構(gòu)象改變而引起的振動(dòng)/轉(zhuǎn)動(dòng)模式演化進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量。

研究者已經(jīng)利用THz-TDS技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)展開(kāi)了一系列研究。Markelz等[7]首次利用THz-TDS研究了DNA、牛血清蛋白和膠原質(zhì)在0.06～2.00 THz波段的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些生物分子的THz譜可以很好地反映它們的低頻集體振動(dòng)模式。他們對(duì)集體振動(dòng)模式的馳豫極化進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，生物大分子在THz波段的介電響應(yīng)譜帶范圍較寬且特征吸收并不明顯，但該響應(yīng)卻對(duì)水合作用、溫度、綁定、構(gòu)造改變等高度敏感[6]。He等[8]通過(guò)THz-TDS技術(shù)研究天然狀態(tài)和變性的雞蛋清溶菌酶的動(dòng)態(tài)躍遷，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不是產(chǎn)生動(dòng)態(tài)躍遷的必要因素，而與溫度相關(guān)。Havenith等[9]利用THz-TDS研究了蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中的THz電場(chǎng)衰減和相轉(zhuǎn)移，并與熒光法、圓二色譜、小角度X射線散射的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)THz譜可檢測(cè)折疊早期和二級(jí)結(jié)構(gòu)形成時(shí)結(jié)合水-蛋白質(zhì)相互作用的重排現(xiàn)象，證明了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成與溶劑動(dòng)力學(xué)相關(guān)。Chen等[10]利用THz-TDS觀察到了PsbO蛋白的可逆性構(gòu)象變化。以上研究都證明了利用THz-TDS譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化的巨大潛力。上述THz-TDS對(duì)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)研究多在溶液中或水合狀態(tài)下進(jìn)行，用其研究固體蛋白質(zhì)的溫度穩(wěn)定性還未見(jiàn)諸文獻(xiàn)報(bào)道。

本文利用太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)對(duì)膠原蛋白從25℃至120℃的加熱變性過(guò)程進(jìn)行了THz光譜測(cè)量，發(fā)現(xiàn)加熱后的吸收和折射譜均逐漸減小，與DSC測(cè)量結(jié)果對(duì)比，確認(rèn)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了解折疊的熱變性過(guò)程。然后，把吸收率和折射率轉(zhuǎn)化為介電譜，并利用一階Debye模型擬合加熱過(guò)程中膠原蛋白的介電譜，獲得了相應(yīng)的弛豫時(shí)間，發(fā)現(xiàn)這些弛豫時(shí)間隨溫度變化而逐漸變大，與加熱過(guò)程中分子內(nèi)部構(gòu)象解折疊變性過(guò)程中的偶極矩變化對(duì)應(yīng)，并可以用Arrihenius方程擬合，得到的活化能為5.53 kJ/K·mol。同時(shí)，利用介電弛豫理論對(duì)其變化進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步利用THz-TDS技術(shù)研究固態(tài)蛋白質(zhì)及多肽類(lèi)藥物的溫度穩(wěn)定性進(jìn)行了有益的探索。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料及裝置

膠原蛋白為購(gòu)自Sigma公司的牛肌腱膠原蛋白I型，純度大于95%以上，樣品為絮狀晶體粉末，實(shí)驗(yàn)前未經(jīng)進(jìn)一步純化處理。實(shí)驗(yàn)前，在4 MPa壓力下將膠原蛋白制備成直徑為13 mm、厚度約為1.5 mm左右的結(jié)構(gòu)均勻且兩端面平行的測(cè)試樣品。然后，分別在變溫裝置中測(cè)量樣品在25、50、75和120℃下的THz時(shí)域譜。加熱完成后，在返回25℃時(shí)，再測(cè)量一次樣品的THz時(shí)域譜。

THz-TDS實(shí)驗(yàn)裝置是購(gòu)自美國(guó)Zomega公司的Z-2太赫茲時(shí)域光譜系統(tǒng)[12]，該系統(tǒng)信噪比可達(dá)70 dB，整個(gè)測(cè)量環(huán)境為干燥的氮?dú)猸h(huán)境，相對(duì)濕度為0%。

示差掃描量熱儀為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品，型號(hào)為Metttler SMP/PF7548/MET/600 W，升溫速率設(shè)置為10℃/min，試樣測(cè)量時(shí)的氣氛為空氣，鋁坩堝作為參考。

數(shù)據(jù)處理及理論方法

樣品THz光學(xué)參數(shù)的提取采用Duvillaret等人[13]提出的方法，參考信號(hào)和樣品信號(hào)分別是通過(guò)測(cè)量氮?dú)夂蜆悠返奈宕纹骄玫腡Hz時(shí)域信號(hào)。將時(shí)域信號(hào)進(jìn)行快速傅里葉變換得到參考和樣品的THz頻域信號(hào)，分別記為Eref(ω)和Esam(ω)，兩者相除可以得到傳遞函數(shù)H(ω)：

其中，?=n－ik，代表樣品的復(fù)折射率，n為折射率，k是消光系數(shù)；ω代表頻率；d表示樣品厚度；ρ(ω)為H(ω)的振幅；φ(ω)為H(ω)的相位。經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)可以得到樣品的折射率 n(ω)、消光系數(shù) k(ω)、吸收系數(shù) α(ω)和復(fù)介電譜ε~(ω)等光學(xué)參數(shù)。

介電譜描述物質(zhì)或體系的介電常數(shù)隨電場(chǎng)頻率的變化，本質(zhì)上是物質(zhì)與電磁波相互作用的結(jié)果，從近紅外到紫外的大約1011～1016Hz頻率段，反映了電磁場(chǎng)與原子的外層電子、晶體中的原子或離子相互作用的位移極化及分子偶極極化響應(yīng)。其中，THz介電譜對(duì)分子轉(zhuǎn)動(dòng)和分子間相互作用非常敏感，可以從介電弛豫過(guò)程中了解分子運(yùn)動(dòng)的特征時(shí)間，獲得與分子結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的大量信息[6]。

弛豫是指系統(tǒng)在外力場(chǎng)的作用下 (如力場(chǎng)，電場(chǎng)、磁場(chǎng)和化學(xué)勢(shì)場(chǎng))，從一個(gè)平衡態(tài)過(guò)渡到另一個(gè)平衡態(tài)時(shí)經(jīng)歷的過(guò)程，其描述特征參量為弛豫時(shí)間，若該過(guò)程必須克服高度為△E的能壘，Kauzmann等人[14]指出該弛豫響應(yīng)對(duì)應(yīng)一個(gè)激活反應(yīng)，相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)變化和鍵的破壞與重排導(dǎo)致偶極子運(yùn)動(dòng)變化，則弛豫時(shí)間可以描述為：

其中，kb是玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，τ0稱(chēng)為指前因子，△E一般也被稱(chēng)為激活能或活化能等，符合Arrhenius方程描述的規(guī)律。Markelz等[15]研究發(fā)現(xiàn)，可以用單一弛豫時(shí)間Debye模型來(lái)表征固態(tài)蛋白質(zhì)分子在溫度變化過(guò)程中，由于分子結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的介電弛豫響應(yīng)過(guò)程，其表達(dá)式為：

本文認(rèn)為，介電弛豫時(shí)間可以反應(yīng)分子構(gòu)象隨溫度發(fā)生的變化。蛋白質(zhì)分子通過(guò)加熱從天然態(tài)到變性狀態(tài)過(guò)程中分子的解折疊過(guò)程，可用弛豫時(shí)間加以定量刻畫(huà)。而活化能則反映該加熱變性過(guò)程的難易程度，可以作為蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的一個(gè)定量指標(biāo)。

結(jié)果與討論

膠原蛋白的THz光譜

分別在變溫裝置中測(cè)量25、50、75和120℃下固體膠原蛋白樣品THz的時(shí)域譜，經(jīng)過(guò)傅里葉變換得到頻域譜，利用公式(2)～(4)得到樣品的THz吸收系數(shù)和折射率，如圖1所示。

從圖1中可以看出，膠原蛋白的吸收曲線比較平滑，呈現(xiàn)一種類(lèi)似玻璃態(tài)的響應(yīng)，是諧振和弛豫過(guò)程的一種積分效果[6]。膠原蛋白加熱過(guò)程中的吸收譜和折射譜整體上呈減小趨勢(shì)，可能有兩方面的原因，一方面，經(jīng)過(guò)凍干處理的膠原蛋白仍含有少量維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)晶水和水合水，加熱將會(huì)使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)晶水和表面的水合水的水分子減少，而水分子在THz波段的吸收率和折射率都比較大；另一方面，膠原蛋白分子中含有的螺旋結(jié)構(gòu)在加熱激活的過(guò)程中具有伸展和解折疊的趨勢(shì)。加熱變性過(guò)程在吸收譜中的變化不十分明顯，但在折射率譜中則非常清晰，這體現(xiàn)了THz-TDS的優(yōu)勢(shì)。已知在加熱到一定溫度后，膠原蛋白還將發(fā)生不可逆的熱變性過(guò)程，即使溫度重新降到室溫時(shí)，膠原蛋白分子也不能恢復(fù)到變性前的各級(jí)構(gòu)象結(jié)構(gòu)。可以從圖1中看到，加熱后返回25℃時(shí)測(cè)量的吸收系數(shù)和折射率與開(kāi)始25℃時(shí)的值相差較大，而與120℃時(shí)測(cè)量的比較接近，說(shuō)明了加熱變性的不可逆性。為了證實(shí)本文膠原蛋白樣品加熱到120℃時(shí)已經(jīng)發(fā)生了不可逆的熱變性過(guò)程，我們用DSC法測(cè)量了相同樣品，得到膠原蛋白在加熱過(guò)程中的熱流變化軌跡 (如圖2所示)。可以看到，本實(shí)驗(yàn)樣品在100℃左右發(fā)生了熱變性。

為了定量分析這種加熱過(guò)程對(duì)膠原蛋白分子THz波段介電響應(yīng)的改變，分別用公式(5)和公式(7)計(jì)算擬合了膠原蛋白THz介電譜的虛部和實(shí)部，見(jiàn)圖3(A)～(D)。從圖3介電譜中可以更加清晰地看到，膠原蛋白分子在脫水過(guò)程和解折疊期間發(fā)生了顯著的偶極矩變化，對(duì)應(yīng)的弛豫時(shí)間相應(yīng)變化。這也是多數(shù)吸收譜光譜無(wú)法提供的重要信息。

圖3(C)和(D)擬合的結(jié)果說(shuō)明，可以用一階Debye模型來(lái)表征固態(tài)蛋白質(zhì)分子在加熱過(guò)程中由于分子結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致的介電弛豫響應(yīng)過(guò)程，與文獻(xiàn)[15]的結(jié)論一致。同時(shí)，表1給出了加熱過(guò)程中樣品在25、50、75和120℃及返回25℃時(shí)，擬合得到的單一弛豫時(shí)間τ的一階Debye模型的各個(gè)參數(shù)。從表1中可以看出，膠原蛋白分子的弛豫時(shí)間隨著溫度的升高而逐漸變大，說(shuō)明固體蛋白質(zhì)的熱變性是構(gòu)象漸變過(guò)程，即變性過(guò)程中維系膠原蛋白空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞，原有的空間結(jié)構(gòu)改變，整個(gè)分子的形狀具有從天然緊密的球形結(jié)構(gòu)伸展為松散的無(wú)特定空間結(jié)構(gòu)的鏈狀分子的趨勢(shì)；另外，返回25℃時(shí)測(cè)量的弛豫時(shí)間與開(kāi)始25℃時(shí)的值相差較大，而與120℃時(shí)測(cè)量的比較接近，不難推測(cè)，膠原蛋白在加熱變性后，不但失去了水合水分子，而且空間構(gòu)象復(fù)雜度降低，膠原蛋白分子中含有的三個(gè)多肽超螺旋結(jié)構(gòu)在加熱激活過(guò)程中具有伸展的趨勢(shì)，這使其THz介電響應(yīng)的偶極矩改變，相應(yīng)的弛豫時(shí)間變長(zhǎng)，且該變性過(guò)程不可逆，變性后的空間結(jié)構(gòu)在返回室溫時(shí)基本保持不變。該現(xiàn)象可以用蛋白質(zhì)變性的漸變模型做較好的解釋[16]，即固體蛋白質(zhì)的熱變性過(guò)程是從天然態(tài)逐漸過(guò)渡到變性態(tài)的漸變過(guò)程，除自然態(tài)和變性態(tài)之外，還存在若干過(guò)渡態(tài)。

表1 擬合得到的膠原蛋白加熱過(guò)程中及返回25℃時(shí)的弛豫時(shí)間Table 1 Fitted relaxation time for collagen during heating and back to 25℃

為了進(jìn)一步定量分析這種由加熱引起的膠原蛋白變性過(guò)程，本文發(fā)現(xiàn)可以利用公式(6)給出Arrhenius方程擬合加熱過(guò)程中的弛豫時(shí)間τ(如圖4所示)，計(jì)算得到變性過(guò)程的活化能為5.53 kJ/K·mol，可以定量刻畫(huà)加熱變性過(guò)程的難易程度。這也印證了玻璃態(tài)動(dòng)力學(xué)理論可以用于蛋白質(zhì)熱變性的研究，說(shuō)明蛋白質(zhì)是一種韌性玻璃態(tài)物質(zhì)[17]。無(wú)定形固體分為韌性玻璃態(tài)和脆性玻璃態(tài)物質(zhì)兩大類(lèi)，其中，韌性玻璃態(tài)物質(zhì)的許多動(dòng)力學(xué)性質(zhì)滿足Arrhenius方程。固體蛋白質(zhì)作為玻璃態(tài)物質(zhì)，其分子主骨架無(wú)法大幅移動(dòng)，而側(cè)鏈則可以擺動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，形成不同構(gòu)象。

結(jié)論及展望

本文利用太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)，對(duì)膠原蛋白從25℃至120℃的加熱變性過(guò)程進(jìn)行了THz光譜測(cè)量，發(fā)現(xiàn)加熱前后的吸收和折射譜有明顯變化。主要原因是加熱將會(huì)使蛋白質(zhì)原有表面的水分子減少，且高溫加熱使得分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)果吸收減小，折射率變小。變性后膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了不可逆的根本變化。同時(shí)，利用一階Debye模型擬合了加熱過(guò)程中膠原蛋白的介電譜，獲得了相應(yīng)的弛豫時(shí)間，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白分子的脫水過(guò)程和折疊結(jié)構(gòu)改變期間發(fā)生了顯著的偶極矩變化，弛豫時(shí)間隨著溫度的升高而逐漸變大，說(shuō)明膠原蛋白的加熱變性是構(gòu)象漸變過(guò)程。弛豫時(shí)間隨溫度的變化滿足Arrihenius方程，擬合得到的活化能為5.53 kJ/K·mol，該數(shù)值表征了膠原蛋白加熱變性過(guò)程的難易程度，給出了其在固態(tài)下熱穩(wěn)定性的定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)印證了固態(tài)蛋白質(zhì)可以被看做一種韌性玻璃態(tài)物質(zhì)，在分子主骨架不能移動(dòng)的情況下，其側(cè)鏈在不同構(gòu)象間轉(zhuǎn)換的時(shí)間為皮秒量級(jí)。

我們下一步的工作將結(jié)合分子模擬計(jì)算工具，全面揭示膠原蛋白加熱變性的物理機(jī)理，特別是其非諧振弛豫響應(yīng)無(wú)法被常用分子模擬軟件中的正規(guī)諧振模式所包含的、來(lái)自蛋白分子的肽鏈在THz電磁場(chǎng)作用下的偶極子弛豫過(guò)程[15]，因?yàn)檫@些非諧振響應(yīng)必須通過(guò)計(jì)算整個(gè)體系中所有分子的運(yùn)動(dòng)軌跡才能全面揭示。

1. Wright NT,Humphrey JD.Denaturation of collagen via heating：An irreversible rate process.Annu Rev Biomed Eng,2002,4：109～128

2.Xia ZY,Calderon-Colon X,Trexler M,Elisseeff J,Guo QY.Thermal denaturation of type I collagen vitrified gels.Thermochim Acta,2012,527(10)：172～179

3. Yoshioka S,Aso Y,Kojima S,Sakurai S,Fujiwara T,Akutsu H. Molecular mobility of protein in lyophilized formulations linked to the molecular mobility of polymer excipients,as determined by high resolution 13C solid-state NMR.Pharmaceut Res,1999,16(10)：1621～1625

4. Frauenfelder H,Petsko GA,Tsernoglou D.Temperaturedependent X-ray diffraction as a probe of protein structural dynamics.Nature,1979,280(5723)：558～563

5. Shinyashiki N,Yamamoto W,Yokoyama A,Yoshinari T,Yagihara S, Kita R, Ngai KL, Capaccioli S. Glass transitions in aqueous solutions of protein(bovine serum albumin).J Phys Chem B,2009,113(43)：14448～14456

6. Markelz AG.Terahertz dielectric sensitivity to biomolecular structure and function.IEEE J Sel Top Quantum Electron,2008,14(1)：180～190

7. Markelz AG,Roitberg A,Heilweil EJ.Pulsed terahertz spectroscopy of DNA,bovine serum albumin and collagen between 0.1 and 2.0 THz.Chem Phys Lett,2000,320(1)：42～48

8.He YF,Ku PI,Knab JR,Chen JY,Markelz AG.Protein dynamical transition does not require protein structure.Phys Rev Lett,2008,101(17)：178103

9.Leitner DM,Gruebele M,Havenith M.Solvation dynamics of biomolecules：Modeling and terahertz experiments.HFSP J,2008,2(6)：314～323

10. Chen H, Chen GY, Li SQ, Wang L. Reversible conformational changes of PsbO protein detected by terahertz Time-domain spectroscopy.Chin Phys Lett,2009,26(8),084204.DOI：10.1088/0256-307X/26/8/084204

11.Kambara O, Tamura A, Uchino T, Yamamoto K,Tominagal K. Terahertz time-domain spectroscopy of poly-L-lysine.Biopolymers,2010,93(8)：735～739

12.Li XJ,Hong Z,He JL,Chen YQ.Precisely optical material parameter determination by time domain waveform rebuilding with THz time-domain spectroscopy. Opt Commun,2010,283(23)：4701～4706

13.Duvillaret L,Garet F,Coutaz JL.A reliable method for extraction of material parameters in terahertz time-domain spectroscopy.IEEE J Sel Top Quantum Electron,1996,2(3)：7739～7746

14.Kauzman NW.Dielectric relaxation as a chemical rate process.Rev Mod Phys,1942,14(1)：12～44

15.Lipps F,Levy S,Markelz AG.Hydration and temperature interdependence of protein picosecond dynamics. Phys Chem Chem Phys,2012,14(18)：6375～6381

16.薩楚爾夫,羅遼復(fù).蛋白質(zhì)變性的漸變模型.內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)漢文版),2002,31(1)：26～30 Sachurfu, Luo LF. A sequential model on protein denaturation.J Inn Mong Norm Univ(Nat Sci Ed),2002,31(1)：26～30

17.Chang L,Pikal MJ.Mechanisms of protein stabilization in the solid state.J Pharmaceut Sci,2009,98(9)：2886～2908