磷壁酸在細(xì)菌黏附、定植及免疫調(diào)節(jié)過程中的作用

王進(jìn)波 倪 江 高權(quán)新，2 齊莉莉*

(1.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，寧波 315100;2.中國水產(chǎn)科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090)

腸道是動(dòng)物重要的消化吸收器官和最大的免疫器官，不僅負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，而且可產(chǎn)生大量的抗體、抗菌肽及白細(xì)胞介素(IL)等活性成分，維持機(jī)體健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，豬腸道中生存著約400種各類微生物，在正常生理狀況下，這些微生物的組成和種類保持相對(duì)平衡，形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)［1］;平衡穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)能夠促進(jìn)腸道組織發(fā)育成熟，激活腸道免疫應(yīng)答反應(yīng)，抑制病原的生長繁殖，參與腸道細(xì)胞的能量、氨基酸代謝［2-6］。因此，有科學(xué)家將腸道微生物稱為機(jī)體的一個(gè)“器官”［7］。如果腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡，有害微生物大量繁殖，就會(huì)引起機(jī)體炎癥，甚至導(dǎo)致肥胖、糖尿病或是腫瘤等疾?。?］。近年來腸道微生態(tài)已成為國內(nèi)外動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。腸道微生物通過何種菌體成分與相關(guān)受體結(jié)合，黏附、定植在腸道黏膜細(xì)胞上?有益菌通過何種機(jī)制發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用?這2個(gè)問題更是受到廣大學(xué)者關(guān)注。

1 磷壁酸(teichoic acid)的結(jié)構(gòu)與功能

磷壁酸是大多數(shù)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的重要成分，是一類由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇構(gòu)成的陰離子聚合物，因其鏈上羥基往往被丙氨酸(Ala)或N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)修飾，故通常還帶有一定量的正電荷，形成正負(fù)電荷交替出現(xiàn)的鏈狀聚合物結(jié)構(gòu)［9-10］。按照在菌體上的分布，磷壁酸可分為2類，一類是壁磷壁酸(wall teichoic acid，WTA)，錨定到細(xì)胞壁肽聚糖上;另一類是脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)，錨定到細(xì)菌細(xì)胞膜上［10-11］，見圖1-A。磷壁酸對(duì)革蘭氏陽性菌具有十分重要的生理功能(圖1-B)，主要包括:1)保護(hù)細(xì)菌免受抗生素、表面活性劑、抗菌肽、溶菌酶和熱應(yīng)激等的損傷;2)維持細(xì)菌細(xì)胞壁中陽離子的濃度平衡;3)參與細(xì)菌細(xì)胞分裂;4)參與細(xì)菌自溶過程;5)參與宿主細(xì)胞相關(guān)受體的識(shí)別與互作［11-13］。對(duì)宿主細(xì)胞而言，磷壁酸則是重要的細(xì)菌抗原分子，能夠影響其免疫應(yīng)答反應(yīng)［14］。越來越多的研究表明，磷壁酸在革蘭氏陽性菌與宿主細(xì)胞的互作及免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著十分重要的作用［11-14］。

2 磷壁酸在細(xì)菌的黏附、定植過程中的作用

磷壁酸在革蘭氏陽性菌的黏附、定植過程中發(fā)揮著重要作用。tagO是細(xì)菌體內(nèi)合成磷壁酸關(guān)鍵酶的編碼基因，Weidenmaier等［15］構(gòu)建了金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)磷壁酸合成缺陷型的tagO基因突變體，利用大鼠鼻腔黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行的黏附試驗(yàn)表明，該突變體的黏附率降低了90%以上。利用熒光標(biāo)記的磷壁酸對(duì)HNEC和A549細(xì)胞進(jìn)行黏附試驗(yàn)，可觀察到磷壁酸直接黏附到細(xì)胞膜上［15］。Holland 等［16］對(duì)表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的研究證明，與野生型相比，tagO突變體形成生物膜能力和黏附能力均顯著降低(P ＜0.05)。Gao等［17］提取、純化了丁酸梭菌(Clostridium butyricum)磷壁酸，并通過排斥試驗(yàn)和競(jìng)爭試驗(yàn)證明，磷壁酸在丁酸梭菌的黏附、定植過程中發(fā)揮重要作用。上述研究表明，磷壁酸在細(xì)菌的黏附、定植過程中發(fā)揮著重要的作用。為了更加深入地研究磷壁酸黏附的分子機(jī)理，Abachin等［18］利用基因突變技術(shù)構(gòu)建李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)dltA基因突變體(dltA-)，dltA-菌磷壁酸不能進(jìn)行丙氨酸修飾，結(jié)果dltA-L.monocytogenes在細(xì)胞表面的黏附數(shù)量顯著下降(P＜0.05)，這說明磷壁酸上的丙氨酸殘基對(duì)L.monocytogene在細(xì)胞表面的黏附具有重要作用。對(duì)羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的研究則表明，磷壁酸丙氨酸殘基缺失對(duì)該菌在小鼠胃腸道中形成生物膜的能力有顯著影響(P＜0.05)［19］。這些研究表明，丙氨酸殘基共價(jià)修飾對(duì)于磷壁酸在黏附、定植過程中發(fā)揮功能具有重要意義。需要指出的是，細(xì)菌在宿主細(xì)胞膜上的黏附、定植是一個(gè)多層次、多階段、多因子參與的復(fù)雜過程，并不僅僅是一種因子作用的結(jié)果，還需多種因子的共同參與。對(duì)金黃色葡萄球菌黏附、定植機(jī)理的研究表明，磷壁酸在細(xì)菌與宿主互作的起始識(shí)別過程中發(fā)揮重要作用，而細(xì)菌的某些蛋白質(zhì)因子則在長期、持續(xù)的黏附、定植過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20-21］。

圖1 革蘭氏陽性菌的磷壁酸及其生理功能Fig.1 The teichoic acid from Gram-positive bacteria and its physiological functions［12］

3 磷壁酸在免疫調(diào)節(jié)過程中的作用

革蘭氏陽性菌磷壁酸在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是機(jī)體重要的炎癥因子，Morath等［22］的體外研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌磷壁酸能夠刺激肝素化全血炎癥因子產(chǎn)生TNF-α，說明磷壁酸可以刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥。Hermann等［23］的研究證明，金黃色葡萄球菌能夠刺激人全血細(xì)胞 TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10等因子的分泌。Weidenmaier等［24］的研究證明，金黃色葡萄球菌磷壁酸能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)肺膿腫，并刺激人單核淋巴細(xì)胞IL-6、TNF-α等炎癥因子的分泌。肺炎鏈球菌磷壁酸刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力明顯比金黃色葡萄球菌磷壁酸弱，這可能是其結(jié)構(gòu)與金黃色葡萄球菌磷壁酸結(jié)構(gòu)有顯著不同的緣故［25］。益生菌磷壁酸的免疫調(diào)節(jié)作用亦受到廣泛關(guān)注。Kim等［26］發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)磷壁酸能夠抑制金黃色葡萄球菌磷壁酸誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生。Kaji等［27］的研究表明，干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)能夠刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-12的產(chǎn)生，而植物乳桿菌磷壁酸則能夠改變這種作用，刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥抑制因子IL-10，促進(jìn)IL-10/IL-12的平衡。Kang等［28］的研究則證明，植物乳桿菌磷壁酸能夠刺激巨噬細(xì)胞一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎癥作用。然而也有研究指出，與致病菌一樣，乳酸菌磷壁酸亦能刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。Mohamadzadeh等［29］利用基因敲除技術(shù)，獲得了磷壁酸合成缺陷的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)菌株，與野生菌株相比，該突變菌株能夠增加樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)抗炎癥因子IL-10的分泌，減少促炎癥因子IL-12的分泌，這提示磷壁酸是刺激細(xì)胞炎癥的因子。利用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建丙氨酸修飾缺陷的植物乳桿菌Dlt-菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變菌株能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞抗炎癥因子IL-10的產(chǎn)生，減少TNF-α等促炎癥因子的分泌，這提示植物乳桿菌磷壁酸鏈上的丙氨酸殘基可能會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)［30-31］。從上述研究可以看出，磷壁酸的免疫刺激作用，尤其是益生菌磷壁酸的免疫調(diào)節(jié)功能，尚沒有形成一致的研究結(jié)論，需要更加全面深入地研究。

4 磷壁酸的主要識(shí)別、黏附受體蛋白

革蘭氏陽性菌的磷壁酸通過與腸黏膜細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)受體互作，從而黏附、定植并激活宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)。利用清道夫受體A(scavenger receptor A，SR-A)特異性抑制劑多聚肌苷酸(polyinosinic acid)進(jìn)行的試驗(yàn)表明，金黃色葡萄球菌磷壁酸可能通過與細(xì)胞膜上的SR-A蛋白互作，黏附到細(xì)胞膜上［32］。Hermann 等［23］的研究指出，金黃色葡萄球菌磷壁酸可以與上皮細(xì)胞膜上的Toll樣受體-2(TLR-2)、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、脂多糖受體(CD14)等受體蛋白相互作用，激活免疫反應(yīng)。用CD14基因敲除小鼠進(jìn)行的研究證明，金黃色葡萄球菌磷壁酸可通過CD14受體激活細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)［24］。另外的一些研究也發(fā)現(xiàn)，磷壁酸通過細(xì)胞膜上的TLR-2受體，激活宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)［27，33-34］。

5 小結(jié)

從國內(nèi)外研究進(jìn)展看，盡管人們對(duì)革蘭氏陽性菌磷壁酸在黏附、定植及免疫調(diào)節(jié)過程中的作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但是仍存在著以下問題:1)關(guān)于磷壁酸在黏附定植作用主要來自對(duì)金黃色葡萄球菌的研究，其在腸道益生菌黏附定植中的作用缺乏全面、深入的研究。2)在黏附定植和免疫調(diào)節(jié)過程中，宿主細(xì)胞膜上與磷壁酸直接互作的受體究竟是哪種蛋白質(zhì)分子?參與2個(gè)過程的受體是否為同一蛋白質(zhì)?黏附定植與免疫調(diào)節(jié)這2個(gè)過程之間有何關(guān)系?3)益生菌和致病菌2種不同來源的磷壁酸在免疫刺激過程中的作用有何不同?

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