秋水仙素誘導(dǎo)榨菜四倍體的效應(yīng)

于錫宏，張艷梅,2，蔣欣梅，齊 月

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省京福龍農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司，哈爾濱 150001）

榨菜（Brassica juneea Czern.et Coss.var.tumida）屬十字花科蕓苔屬芥菜種中肉質(zhì)莖可食用的一個(gè)變種，屬于莖用芥菜，通常作為蔬菜、油料和調(diào)料作物栽培。榨菜是中國(guó)特產(chǎn)蔬菜，為腌菜中的佳品，國(guó)際市場(chǎng)上與歐洲酸菜、日本醬菜齊名，被譽(yù)為世界三大名腌菜之一，在我國(guó)蔬菜加工生產(chǎn)中占有重要地位[1]。

多倍體育種是植物育種的重要途徑之一，不僅可以改良性狀，還可以提高植物體內(nèi)相關(guān)成分的含量[2-3]。多倍體對(duì)高等植物的進(jìn)化有重要作用，在植物性狀上多表現(xiàn)出花大、果大、葉大等器官的巨大性，可以提高植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性。多倍體誘導(dǎo)在十字花科蔬菜中應(yīng)用極少，前人曾利用秋水仙素誘導(dǎo)同源四倍體蘿卜[4]，或?qū)Π撞撕透仕{(lán)的小孢子植株進(jìn)行二倍化[5-6]。榨菜主要在南方大面積栽培，北方現(xiàn)也有少量種植（但在北方的高寒地區(qū)尚未有露地種植成功的報(bào)道）。北方栽培榨菜在生產(chǎn)中有一定難度，表現(xiàn)為植株易生病，早抽薹開花，不結(jié)球莖，為能夠得到穩(wěn)定遺傳的榨菜株系，解決榨菜在北方種植的難題，本試驗(yàn)在組織培養(yǎng)條件下，通過用不同濃度的秋水仙素對(duì)榨菜外植體進(jìn)行不同時(shí)間的處理，探討榨菜多倍體的誘導(dǎo)最佳方案，通過染色體制片顯微觀察，旨在探索一般條件下誘導(dǎo)榨菜染色體加倍的有效方法，以期獲得更多的多倍體榨菜種質(zhì)材料，豐富榨菜種質(zhì)資源，加速適于北方栽培的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜的育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2010～2011年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝中心日光溫室內(nèi)及蔬菜設(shè)施工程與環(huán)境調(diào)控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。榨菜株系為B2-1014，為本試驗(yàn)室多年選育的一份具有遲抽薹特性的材料；激素為6-BA、2，4-D、NAA、秋水仙素由鄭州綠博生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得

參照陳竹君等方法[7]，將精選后的榨菜種子先用70%酒精振蕩滅菌90 s后，加入10%的次氯酸鈉溶液振蕩滅菌10 min。然后經(jīng)無(wú)菌水沖洗5次后接種于MS培養(yǎng)基上。于（25±2）℃光下培養(yǎng)，光強(qiáng)為2 000 lx，光照時(shí)間為每天16 h。

1.2.2 秋水仙素處理榨菜下胚軸

以B2-1014為試驗(yàn)材料，根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，將培養(yǎng)4 d的榨菜無(wú)菌苗下胚軸與培養(yǎng)5 d的榨菜無(wú)菌苗莖尖，切成0.5 cm小段，接種于含秋水仙素濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，處理時(shí)間為0、12、24、36、48、60 h，培養(yǎng)基中均添加 30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂[8]、激素為 0.5 mg·L-16-BA、0.8 mg·L-1NAA。每處理外植體30個(gè)，3次重復(fù)。

外植體在含有秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的時(shí)間，然后取出轉(zhuǎn)移到不含秋水仙素，其他成分相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，14 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，16 d后將獲得的不定芽進(jìn)一步分割，切成2～3 cm的再生芽，接種于含不同濃度0.2 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3周后觀察根發(fā)生情況，再進(jìn)行染色體倍性鑒定。

將鑒定后的四倍體榨菜植株轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)缽中，2周后在溫室中定植，以二倍體榨菜作對(duì)照，進(jìn)行性狀觀察。

1.2.3 染色體倍性鑒定

利用染色體計(jì)數(shù)法進(jìn)行倍性鑒定，待培養(yǎng)基內(nèi)根尖長(zhǎng)至1.5～2.0 cm時(shí)，于上午8：00～9：00剪下幼嫩根尖，放入5%對(duì)二氯苯溶液中，10～20℃條件下處理3 h，用自來(lái)水洗凈放在卡諾固定液固定（2～24 h）后，依次放入90%、80%、70%酒精中，最后保存于70%酒精溶液中，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。檢測(cè)時(shí)從保存液中取出根尖，用自來(lái)水沖洗掉酒精，然后將水洗后的根尖放到1 mol·L-1HCI中，60℃水浴中解離15 min后，倒去解離液，用蒸餾水沖洗酸解后的根尖2～3次，小心切取根尖置于載玻片中央，加入改良石碳酸品紅進(jìn)行染色，靜置15 min后，蓋上蓋玻片，壓片，最后把壓好的片子置于顯微鏡下觀察、鑒定染色體數(shù)目并攝影。觀察的細(xì)胞數(shù)不少于30個(gè)，檢測(cè)的分裂細(xì)胞中85%以上為恒定一致的染色體數(shù)即為該植物的染色體數(shù)。氣孔觀察采用直接剝離法[9]，用鑷子直接剝離或撕下樣品下表皮，將剝離的葉片下表皮平展在滴有水滴的載玻片上，蓋上蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。誘變率（%）=（嵌合體數(shù)+多倍體數(shù)）/處理數(shù)×100%；多倍體誘導(dǎo)率（%）=多倍體數(shù)/處理數(shù)×100%。用普通光學(xué)顯微鏡（Olympus CX31）進(jìn)行觀察和拍照（相機(jī)為Nikon ECLIPSE 90i）。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

利用DPS 9.50軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素不同濃度及處理時(shí)間對(duì)下胚軸誘導(dǎo)多倍體的影響

下胚軸組織培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體效果如表1所示，以秋水仙素濃度為0.4%，處理時(shí)間為48 h誘變四倍體的效率最高，為15.6%，雖然有部分死亡，但變異率和誘變率在外植體培養(yǎng)中最高。

2.2 秋水仙素及處理時(shí)間對(duì)莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)誘導(dǎo)多倍體的影響

不同秋水仙素濃度處理莖尖不同時(shí)間的誘導(dǎo)效果統(tǒng)計(jì)如表2所示，秋水仙素濃度為0.4%，處理時(shí)間為48 h時(shí)誘導(dǎo)多倍體最高，變異率為61.1%，誘變率為30.0%。根據(jù)表1和表2的統(tǒng)計(jì)，二者均是在相同處理時(shí)間內(nèi)，隨著秋水仙素濃度的升高，變異株數(shù)增加，直到秋水仙素濃度為0.5%時(shí)不再增加。隨濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，植株的死亡率逐漸上升。二者誘導(dǎo)多倍體的效果不一致，以莖尖的誘導(dǎo)率最高，其中變異率為61.1%，誘變率為30.0%，都高于下胚軸，所以以莖尖為外植體，處理濃度為0.4%，時(shí)間為48 h為最佳組合。

表1 秋水仙素不同濃度及處理時(shí)間對(duì)下胚軸誘導(dǎo)多倍體的影響Table1 Induction effect of colchicines under different concentrations and treatment time on hypocotyledonary

表2 秋水仙素不同濃度及處理時(shí)間對(duì)莖尖誘導(dǎo)多倍體的影響Table2 Induction effect of colchicines under different concentrations and treated time on stem tip as explants

續(xù)表

2.3 榨菜四倍體植株鑒定

榨菜正常染色體個(gè)數(shù)為2n=2x=36，但本試驗(yàn)的榨菜B2-1014株系染色體數(shù)為2n=24，四倍體植株的染色體數(shù)為2n=4x=48，其中嵌合體多為二倍體和四倍體的嵌合體（見圖版Ⅰ-A、B，此圖彩版見封二）。四倍體氣孔明顯比二倍體氣孔大，單位面積的氣孔數(shù)明顯減少，保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠素含量明顯增加（見圖版Ⅰ-C、D，此圖彩版見封二）。

圖版Ⅰ 榨菜四倍體植株鑒定（×400）PlateⅠ Tetraploid plant identify in tuber mustard

圖版Ⅰ 榨菜四倍體植株鑒定（×400）PlateⅠ Tetraploid plant identify in tuber mustard于錫宏等：秋水仙素誘導(dǎo)榨菜四倍體的效應(yīng).2013,44(10):88-92.

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)榨菜四倍體植株生長(zhǎng)50 d，與同源二倍體相比，其生長(zhǎng)較緩慢，葉片厚大，葉色濃綠，莖桿短且粗，葉片稍微畸形（見圖版Ⅰ-E、F）。榨菜四倍體植株的株高、莖粗、葉片長(zhǎng)、葉片寬和球莖大小分別比二倍體增加了48.2%、71.4%、68.1%、73.9%和72.1%（見表3）。

表3 榨菜四倍體植株與二倍體植株形態(tài)比較Table3 Morphological comparison of diploid and tetraploid plant in tuber mustard

3 討論

外植體可通過無(wú)菌培養(yǎng)和室外種植獲得，利用無(wú)菌培養(yǎng)的外植體，不需進(jìn)行滅菌，可以直接進(jìn)行接種；從室外種植獲得的外植體需進(jìn)行消毒處理，如果消毒時(shí)間過長(zhǎng)，易使外植體組織受損，接種后很難分化，消毒時(shí)間過短，則消毒不徹底，易造成污染[10]。為此本試驗(yàn)中將試驗(yàn)材料的種子進(jìn)行無(wú)菌處理并在組培條件下獲得無(wú)菌苗，再利用無(wú)菌苗的下胚軸和莖尖兩種外植體進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)，結(jié)果表明同樣條件下以莖尖為外植體誘導(dǎo)效果較好，莖尖處理的四倍體誘變率和成果率分別為30.0%和61.1%，比利用下胚軸處理的分別高13.3%和10%；利用莖尖作為外置體進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)的最佳處理?xiàng)l件組合為秋水仙素濃度0.4%、培養(yǎng)時(shí)間48 h?？梢?，外植體選用的部位、秋水仙素濃度、處理時(shí)間是多倍體誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。

在多倍體誘導(dǎo)過程中，化學(xué)誘變劑有很多種，秋水仙素應(yīng)用的比較廣泛，前人[11-13]在誘導(dǎo)多倍體時(shí)誘導(dǎo)劑使用的多為秋水仙素，采用其他誘變劑對(duì)多倍體誘導(dǎo)也有一定效果，如房超等[14]用抗微管形成的除草劑在西瓜染色體加倍上進(jìn)行試驗(yàn)，認(rèn)為秋水仙素并非最佳的染色體加倍誘導(dǎo)物，低濃度重氮除草劑（Oryzalin）可有效誘導(dǎo)染色體加倍，這類除草劑與紡錘絲蛋白的結(jié)合專一，對(duì)染色體損傷小，引起其他變異的幾率可能比秋水仙素小，并且在這些再生植株中不存在嵌合體和植株生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象[13]。在十字花科蔬菜上應(yīng)用秋水仙素進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)比較多，本試驗(yàn)中對(duì)榨菜材料“B2-1014”進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)采用的是秋水仙素，雖然得到四倍體植株，但誘變率不是很高，采用其他誘變劑可能會(huì)產(chǎn)生更好效果，相關(guān)研究尚待深入進(jìn)行。本試驗(yàn)獲得的多倍體植株還將進(jìn)行田間性狀觀察，以期篩選出有用性狀的多倍體，為榨菜育種提供理論依據(jù)。

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