花生AhFAD8基因的克隆、表達及活性分析

高繼國，惠識瑤,，耿麗麗，張 蕊，孫長坡，張 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.國家糧食局科學研究院，北京 100037）

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長為16～22個碳原子的直鏈脂肪酸[1-2]。根據(jù)多不飽和脂肪酸分子甲基端起第一個不飽和雙鍵所連結的碳原子在碳鏈中的位置不同，將PUFAs分為ω-3和ω-6兩類[3-4]。α-亞麻酸（Alpha-linolenic acid，ALA）是ω-3多不飽和脂肪酸中的一種，對促進人體健康具有重要作用，尤其可以促進大腦發(fā)育[5-6]。ALA是對人體有益的長鏈不飽和脂肪酸二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexenoic acid，DHA）的合成前體物質，ALA通過對同一種必需酶的競爭消耗，抑制ω-6脂肪酸的延伸從而達到平衡人體內ω-3與ω-6脂肪酸水平的功效[7-9]。但是，由于人體內缺乏必要的脫氫酶，不能合成ALA和亞油酸（Linoleic acid，LA）此類基本的脂肪酸，所以只能從飲食中攝取相應的不飽和脂肪酸[10]。

脂肪酸脫氫酶（Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）是催化脂肪酸鏈特定位置形成雙鍵和產(chǎn)生不飽和脂肪酸的酶類。植物脂肪酸脫氫酶主要有ω-3（FAD3、FAD7、FAD8）和ω-6（FAD2、FAD6）兩大類[11-12]，其中FAD2和FAD 3在內質網(wǎng)中，F(xiàn)AD6、FAD 7和FAD 8在脂質中[13-14]。FAD8屬于ω-3脂肪酸脫氫酶，是ALA合成的關鍵酶[15-17]，此酶在LA（18∶2）脂肪酸鏈的距甲基端的第三個碳原子處引入雙鍵生成ALA（18∶3）[18]。

花生（Arachis hypogaea L.）是世界第四大油料作物，花生籽粒含油量約占種子干重的44.27%～53.86%；而其儲藏油脂中80%左右為不飽和脂肪酸（其中油酸36%～67%，亞油酸15%～43%）[19]。目前，花生ω-6脂肪酸脫氫酶基因已被克隆，且已成功將AhFAD2A和AhFAD2B轉入大腸桿菌和釀酒酵母中，誘導表達并分析其脫氫酶活性。但是，對于花生ω-3多不飽和脂肪酸代謝合成以及相關酶的研究還未見報道。牛麗紅等成功克隆擬南芥和萊茵衣藻中的ω-3脂肪酸脫氫酶基因，在畢赤酵母中誘導表達，并且分析其生物活性[20-21]。

本研究生在物信息學分析基礎上，利用電子克隆結合RT-PCR方法克隆花生ω-3脂肪酸脫氫酶基因（FAD8），構建ω-3脂肪酸脫氫酶的真核表達載體，在畢赤酵母中表達，分析其生物學功能，為花生不飽和脂肪酸代謝的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

花生（Arachis hypogaea L.）品種為白沙 1016，由山東省花生研究所提供。

1.1.2 菌株與質粒

大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、pPIC3.5K酵母游離型穿梭表達載體由本實驗室保存，T載體pMD19-T購自TaKaRa公司，RNAsimple Total RNA試劑盒購自Tiangen公司。

1.1.3 試劑和培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 1%，Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，pH 7.0，0.1 MPa滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加入瓊脂，濃度為1.3%。畢赤酵母YDB基礎培養(yǎng)基、RDB篩選培養(yǎng)基及BMGY和BMMY誘導表達培養(yǎng)基等配置方法參照Invitrogen公司畢赤酵母操作說明進行。

抗生素：氨芐青霉素100 mg·mL-1，卡那霉素100 mg·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶及T4DNA連接酶等購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程公司合成；2×Taq Mix PCR擴增試劑購自北京博邁得生物技術有限公司；DNA回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒等購自Axygen公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；其他均為市售國產(chǎn)、進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 ω-3脂肪酸脫氫酶基因的電子克隆

采用DNAMAN軟件比對GenBank中下載的9種植物ω-3脂肪酸脫氫酶基因序列，選取保守片段作為種子序列，利用BioEdit軟件在本實驗室花生不同時期的轉錄組測序數(shù)據(jù)庫中調取同源性較高的序列片段，結合Peanut DB花生數(shù)據(jù)庫（http://www.bioinfolab.org/txid3818v1）（世界上第一個花生數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，由本實驗室完成花生轉錄組測序，與美國Miami University Dr Liang Chun實驗室合作建立）中對于花生ω-3脂肪酸代謝途徑中相關酶的序列信息，得到候選序列。根據(jù)NCBI、EBI、GenBank、EXPACY和Soflberry等網(wǎng)站提供的各種在線生物信息學軟件進行綜合分析預測，并與同類植物已克隆的ω-3脫氫酶進行比較分析，克隆出花生ω-3脂肪酸脫氫酶基因全長序列。引物由上海Sangon合成：

AhFAD85f：5'TACGTAACCATGGCAACATGG GTCTTATC 3'

AhFAD83r：5'GCGGCCGCTTAAATTGATGTA GAAGAGCC 3'

1.2.2 AhFAD8基因全長cDNA序列的獲得

花生未成熟種子總RNA的提取參照Trizol說明書進行，使用RNAsimple Total RNA Kit純化分離mRNA。取1 μg所提總RNA為模板，Oligo（dT）為反轉錄引物，70℃保溫4 min后立即冰浴，然后分別加入 5×primescript buffer 4 μL，dNTP，RNase inhibitor，M-MLV各0.5 μL，加DEPC處理水至20 μL，42℃反應90 min，合成第一鏈cDNA。以AhFAD85f、AhFAD83r為引物，以反轉錄產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增，擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃ 30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 AhFAD8基因克隆、測序

將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pMD19-T載體中，并轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選和酶切鑒定陽性克隆，挑取正確的陽性克隆進行測序。序列測定由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2.4 AhFAD8基因表達載體的構建

利用酶Sna B I和NotⅠ將目的基因片段從pMDFAD8上切下插入pPIC3.5K，得到重組表達載體。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、載體構建、轉化和重組質粒的篩選和鑒定均參見文獻[19]。

1.2.5 畢赤酵母細胞的轉化及陽性克隆的鑒定

用限制性內切酶Sna B I分別對pPIC3.5K及重組載體進行線性化處理，然后采用電穿孔法轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞。電轉化條件參見文獻[20]，取上清液為模板，以AhFAD85f和AhFAD83r為引物進行PCR鑒定，檢驗目的基因是否已整合到畢赤酵母基因組DNA中。從RDB培養(yǎng)基上挑取生長較好的轉化子，進一步轉接到G418濃度分別為1.0、2.0、4.0 mg·mL-1的平板上進行篩選，得到高拷貝轉化子。

1.2.6 酵母工程菌的表達

分別挑取單陽性克隆，接種于裝有BMGY培養(yǎng)基中，28℃，220 r·min-1培養(yǎng)至OD600=3.0；收集菌體，菌體重懸于BMMY培養(yǎng)基中，甲醇終濃度為0.5%，28℃，220 r·min-1誘導表達；每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至其終濃度為0.5%；誘導72 h后，離心收集菌體，菌體用無菌水洗滌3次。

1.2.7 重組基因表達產(chǎn)物樣品的制備

重組表達產(chǎn)物樣品的制備方法詳見文獻[20]。

1.2.8 重組基因表達產(chǎn)物樣品氣相色譜（GC）分析

采用Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱為VF-23MS，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm，分流比100∶1，進樣口溫度260℃，檢測器溫度260℃，程序升溫：110℃3 min，以4℃·min-1的速度上升至220℃保溫15 min。

2 結果與分析

2.1 花生FAD8基因的cDNA克隆與序列分析

擴增得到花生FAD8基因的cDNA，電泳檢測到一條約1.4 kp的條帶（圖略），測序結果表明該cDNA片段含有1 368 bp，由此推測該基因編碼456個氨基酸，與大豆（Glycine max）FAD8（NM0012516 80.1）序列相似性最高，為88%；與大豆等10個物種的FAD8氨基酸序列作多重比對，建立11個物種的FAD8脫氫酶的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，結果表明花生FAD8與（Glycine max）和豇豆（Vigna uiculata chloroplast）進化關系最近，而與畢赤酵母（Pichia pastoris）進化關系最遠。

圖1 11種ω-3脫氫酶的分子系統(tǒng)發(fā)育Fig.1 Molecular phylogenetic tree of 11 kinds of ω-3 FADs

2.2 表達載體的構建及陽性克隆的鑒定

構建表達載體獲得重組質粒p3.5K8（見圖2），挑取陽性克隆，酶切鑒定顯示，p3.5K8經(jīng)Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切分別產(chǎn)生9.3 kb及1.4 kb兩條帶，經(jīng)Sna BⅠ單酶切僅有10.7 kb一條帶；空載體pPIC3.5K經(jīng)同樣酶切僅有9.3 kb一條帶（見圖3），說明AhFAD8基因已成功克隆到pPIC3.5K中。

2.3 AhFAD8基因在畢赤酵母中的表達

以引物AhFAD85f與AhFAD83r對轉化子進行鑒定，結果表明目的基因已整合入畢赤酵母基因組中。RT-PCR檢測結果說明AhFAD8基因在畢赤酵母中能夠正常轉錄（見圖4）。

圖2 p3.5K8質粒的構建Fig.2 Construction of p3.5K8 plasmid

圖3 重組質粒p3.5K8的酶切及PCR分析Fig.3 Restrictive digestion and PCR analysis of recombinant plasmid p3.5K8

2.4 花生FAD8脫氫酶的活性分析

圖4 轉脫氫酶基因畢赤酵母RT-PCR檢測結果Fig.4 RT-PCR Result of Pichia pastoris transformants with desaturase genes

畢赤酵母工程菌經(jīng)細胞破碎、提取、對總脂肪酸進行甲酯化后，經(jīng)GC檢測，對圖譜進行分析，得到畢赤酵母每種具體的脂肪酸的物質的量含量，并依照去飽和率計算4個轉化子亞油酸的去飽和率及平均去飽和率，飽和率（%）=產(chǎn)物含量/（產(chǎn)物含量+底物含量）×100%，結果見表1，結果顯示轉AhFAD8的畢赤酵母比轉空載體pPIC3.5K的畢赤酵母亞油酸的平均去飽和率高。如圖5所示，圖5A為轉空載體對照，圖5B為轉化含AhFAD8基因的畢赤酵母中亞油酸的平均去飽和率，可見轉入AhFAD8基因后亞油酸的平均去飽和率升高25.5%，證明在畢赤酵母中表達的花生FAD8脫氫酶基因具有脫氫活性。

表1 畢赤酵母中亞油酸的去飽和率Table1 Desaturation rate of LA in Pichia pastoris

3 討論與結論

本研究通過多種植物以及畢赤酵母的ω-3脫氫酶基因序列比對分析得到FAD8脫氫酶基因的保守區(qū)，利用本實驗室花生不同時期的轉錄組數(shù)據(jù)以及Peanut BD數(shù)據(jù)庫的信息，結合RT-PCR方法，首次克隆花生AhFAD8脫氫酶全長cDNA，并在畢赤酵母中成功表達該基因，通過不飽和脂肪酸分析證實該基因表達產(chǎn)物具有一定的ω-3脫氫酶活性，為花生以及其他油料作物脂肪酸代謝合成的相關基因研究創(chuàng)造條件。

本研究采用外源蛋白表達系統(tǒng)為巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris），克服釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表達菌株不夠穩(wěn)定、表達質粒易丟失等缺陷[22-24]。其本身含有豐富的油酸和亞油酸，可在不加其他底物的情況下，直接用于脫氫酶基因的生物學功能的驗證[25-27]。通過對脂肪酸脫氫酶的真核表達，摸索出利用畢赤酵母的真核表達的技術路線，為其他脫氫酶基因的真核異源表達提供技術支持。

本研究中AhFAD8基因在畢赤酵母中表達，亞油酸去飽和率由25.9%上升到32.5%，上升25.5%，證實此酶能異源表達，而且具有一定脫氫酶活性。但是，畢赤酵母中ω-3不飽和脂肪酸合成代謝途徑與植物有一定區(qū)別，缺少植物中特有的調控機制，從而影響脂肪酸脫氫酶的表達及活性，后續(xù)研究擬將該脫氫酶基因轉入模式植物擬南芥，并研究其生物活性。

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