胃癌中抑癌基因p16與KLF6蛋白的表達(dá)及相關(guān)性研究

張修穩(wěn)，劉銀華，盧林明，趙國海

(1．肥東縣人民醫(yī)院 普外科，安徽 合肥 231600;2．皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 病理科，安徽 蕪湖 241001;3．皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 胃腸外科，安徽 蕪湖 241001)

胃癌是源自胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占胃惡性腫瘤的95%。在我國，胃癌平均病死率高達(dá)20/10萬，占惡性腫瘤第一位。胃癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)基因的改變，當(dāng)前對胃癌發(fā)生機(jī)制的研究已逐漸從單一基因發(fā)展到多基因協(xié)同作用和互相調(diào)節(jié)的研究。研究表明，在胃癌病例中凡有3個(gè)以上基因發(fā)生變異，大多為分化低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或惡性程度較高［1］。本文通過對胃癌組織中抑癌基因p16和KLF6的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及兩基因相關(guān)性的研究，探討它們在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院胃腸外科2009年1月～2010年9月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的73例胃癌組織和相應(yīng)癌旁5 cm組織;癌旁組織作對照研究。其中男性48例，女性25例，年齡42～79歲，平均(61．32 ±8．296)歲(中位數(shù)年齡55歲)。入選條件:①病史資料齊全;②術(shù)前未經(jīng)放療及化療患者;③病理診斷均為胃腺癌，按《WHO腫瘤國際組織學(xué)新分類》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胃腺癌分級:高分化、中等分化、低分化。觀察并計(jì)數(shù)其淋巴結(jié)的癌轉(zhuǎn)移率。

1．2 試劑 鼠抗人p16、KLF6多克隆抗體、DAB顯色試劑、PBS緩沖液及S-P檢測試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1．3 免疫組織化學(xué)SP法 將普通石蠟切片一式兩份，同一批次進(jìn)行免疫組化染色，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS液洗5 min×3次，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，高壓鍋抗原修復(fù)(修復(fù)液為0．01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6．0)，PBS液洗5 min×3次，兩張切片分別滴加p16和KLF6一抗工作液，4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育15 min，PBS洗5 min×3次，滴加卵白素過氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育10 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色劑顯色7 min。以PBS液代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。

1．4 結(jié)果判定 p16和KLF6陽性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)中有淺黃、棕黃或棕褐色顆粒者為染色陽性，按染色強(qiáng)度判為淺黃(0分)、棕黃(1分)及棕褐色(2分)3級;按照陽性細(xì)胞比例分為＜10%(0分)、10% ～30%(1分)、3l% ～60%(2分)及 ＞60%(3分)4級?？傮w評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度。評分:≤2分者判為陰性;3～6分者為弱陽性;＞6分者為強(qiáng)陽性。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，采用χ2檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 p16、KLF6在癌旁組織中的表達(dá) p16、KLF6的表達(dá)率分別為83．6%、90．41%，均高于胃癌組織中的表達(dá)率32．9%和 39．7%，χ2值分別為 38．549、41．254，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)，見表 1、圖 1～4。

表1 p16與KLF6在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Tab 1 p16 and KLF6 expressed in gastric cancer and adjacent tissues

2．2 胃癌中p16、KLF6蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系 按照胃癌組織各病理特征進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)表明:胃癌組織中p16與KLF6蛋白的表達(dá)均與胃癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度有關(guān)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2．3 胃癌組織中p16、KLF6蛋白表達(dá)的相關(guān)性胃癌組織中p16與KLF6陽性表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0．326，P ＜0．01，表3)。

圖1 胃癌組織p16蛋白陰性表達(dá)，SP×400Fig 1 p16 protein expression in gastric carcinoma，SP ×400圖2 癌旁組織p16蛋白陽性表達(dá)，SP×400Fig 2 p16 protein expression in gastric adjacent tissue，SP×400圖3 胃癌組織KLF6蛋白弱陽性表達(dá)，SP×400Fig 3 KLF6 protein expression in gastric carcinoma，SP ×400圖4 癌旁組織KLF6蛋白陽性表達(dá)，SP×400Fig 4 KLF6 protein expression in gastric adjacent tissue，SP×400

3 討論

P16蛋白是一種周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CDK-inhibitors)，最早由 Kamb 和 Nobori等［2－3］于 1994 年報(bào)道，它通過與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)競爭性結(jié)合周期蛋白依賴性激酶(CDK)，從而抑制 cyclinD1-CDK4或 cyclinD1-CDK6的活性，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)基因的磷酸化受阻，使其不能釋放E2F，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，從而抑制了細(xì)胞的增殖［4］。細(xì)胞周期是個(gè)復(fù)雜的過程，其中G1→S期是細(xì)胞周期調(diào)控限制點(diǎn)之一，其調(diào)控功能受細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDKs)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDK Inhibitors，CDKI)的精密調(diào)節(jié)［5］。因此，如果 p16 基因發(fā)生了突變、缺失，則必然導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖，引起腫瘤的發(fā)生。KLF6(kruppel-like factor 6)是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，定位于人類染色體10P15區(qū)域，表達(dá)產(chǎn)物是含283個(gè)氨基酸的蛋白，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能主要取決于非DNA結(jié)合域內(nèi)的特定激活域或抑制域。其作用機(jī)制是以p53非依賴方式上調(diào)p21，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制［6］。與p16作用機(jī)理類似，KLF6系通過p21使Rb基因的磷酸化受阻，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1，干擾細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細(xì)胞的生長［7］。在哺乳動物細(xì)胞周期中，CDKI與CDKs之間競爭性和cyclin D結(jié)合，共同調(diào)節(jié)G1→S期的限制點(diǎn)，使細(xì)胞生長、分裂與細(xì)胞生長抑制保持平衡狀態(tài)。當(dāng)CDKI缺失或功能異常時(shí)，CDKs與cyclin D1結(jié)合占優(yōu)勢，細(xì)胞周期由G1進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖失控而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［8－9］。研究表明，KLF6在多種腫瘤癌組織中呈低表達(dá)，與癌旁正常組織相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［10－13］。KLF6基因的失活與腫瘤的生長、播散及早期的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密［14］。

表2 胃癌中p16、KLF6蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab 2 The relationship of p16 and KLF6 expression and clinical pathological features

表3 胃癌組織中p16、KLF6蛋白表達(dá)的相關(guān)性Tab 3 Correlation of p16 and KLF6 in gastric cancer tissues

通過對其作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，p16與KLF6基因同為阻止Rb基因的磷酸化而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性進(jìn)入細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖過程的。由于抑癌基因失表達(dá)，致使細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)生異常，細(xì)胞增殖失控而形成腫瘤［15］。本組實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p16與KLF6蛋白在胃癌組織中的表達(dá)基本一致，均顯著低于癌旁正常組織，其失表達(dá)率分別為32．9%和39．7%，而兩者聯(lián)合檢測則它們的聯(lián)合陰性表達(dá)率達(dá)到了52．05%，這對提示胃癌的診斷有了明顯的提高，突顯出聯(lián)合檢測的價(jià)值。進(jìn)一步分組統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在低分化胃癌組織中弱陽性及陰性表達(dá)明顯多于高-中分化胃癌組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩組存在顯著差異，說明p16與KLF6表達(dá)與胃癌惡性程度有關(guān)，惡性程度高，則蛋白表達(dá)低;惡性程度低，則蛋白表達(dá)相對較高。腫瘤浸襲性表現(xiàn)為浸潤性生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，實(shí)驗(yàn)中，有浸潤的胃癌相對于尚未穿透漿膜層的胃癌，表現(xiàn)出更少的蛋白陽性表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，表明兩組間存在顯著差異。這使得p16與KLF6有可能成為預(yù)測胃癌惡性程度及分級的一個(gè)有用指標(biāo)。有研究表明，P16蛋白表達(dá)異常是胃癌發(fā)生的早期事件，且隨著胃癌的發(fā)展而逐步增加［16］。在本實(shí)驗(yàn)中，p16與KLF6蛋白在胃癌中的表達(dá)基本趨于一致，經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)兩基因之間呈正相關(guān)(rs=0．326，P ＜0．01)。二者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)率均低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，隨著浸潤深度的增加和TNM分期的提高呈表達(dá)下降趨勢，說明p16與KLF6在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移和浸潤機(jī)制上存在著一定的抑制效應(yīng)，兩者可能存在協(xié)同作用，并且有可能成為胃癌治療的新靶點(diǎn)，為胃癌靶向治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。

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